We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.
Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.
Xenopus laevis är en allmänt använd, kraftfull modellorganism för att studera utvecklingen 1. Detta beror på Xenopus ägg är ovanligt stora (cirka 1,2 till 1,4 mm, i jämförelse med däggdjurs motsvarigheter är ca 0,1 mm) och riklig. Ägg innehåller matern syntetiserade och lagrade komponenter, som är tillräckligt för att driva embryonal utveckling fram till mitten av blastula övergången (MBT, som inträffar i det skede 8-8,5 med 4,000-8,000 celler). MBT åtföljs av zygotisk genomet aktivering, som sedan producerar embryonala genprodukter som styr vidare utveckling.
Ett flertal studier som syftar till att identifiera matern faktorer som är viktiga för utvecklingen. Många studier lita på injektion av antisensoligonukleotider (oligos) inklusive morfolinogrupper oligonukleotider in befruktade embryon, i vilket fall nedbrytning av moderns proteiner kan observeras vid gastrulastadium 2-4. Alternativt mRNA injiceras befruktade embryos störa genfunktioner eller spåra öden överuttryckta proteiner. Men injektion i embryon de en-cells skede normalt inte påverkar uttrycksnivåer av moderns proteiner vid mycket tidiga embryonala stadier innan MBT.
Heasman och Wylie etablerade värdöverföringsmetod för att övervinna detta problem 5. I deras metod, manuellt defolliculated oocyter injicerade med antisensoligos och överförs till värd honor 6. Proteiner nedregleras före befruktningen så att roller nedregleras proteiner i tidig embryonal utveckling kan undersökas. Denna maternal utarmning metod ledde till identifiering av flera unika utvecklings roller maternal proteiner, som ses över 7.
I denna rapport, vi detalj vår nyutvecklade metod, där mödra utarmning eller överuttryck av mRNA innan befruktningen sker utan manuell defolliculation och värd överföring8. Manuell defolliculation kräver mycket tid och värdöverföring behöver ofta skickliga tekniker och den specifika licens för djurkirurgi, vilket hämmar den frekventa användningen av mödra utarmning metod. Defolliculation och värd överföring ersätts genom enzymatisk defolliculation 9,10 och intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) 11-13, respektive. ICSI ägg användes ursprungligen för att producera transgena grodor 12. Spermier och embryonala kärnor också transplanteras till in vitro mognat amfibie äggceller 11,14,15. Här visar vi vår steg-för-steg-metoden för att injicera spermier i vitro mognat oocyter som var pre-injicerade med antisensoligos eller mRNA.
Vi här i detalj en ny metod för att utarma matern faktorer eller att överuttrycker exogena faktorer innan befruktningen. Detta system kräver två microinjections, men istället hoppar operationen av grodor, som används i den mottagande överföringsmetod 7,17. Det är optimalt att ta bort grodan kirurgi steg när det gäller djuromsorg. Dessutom behöver vi inte ta hänsyn till kvaliteten på värd kvinnliga grodor för överföringsexperiment, vilket innebär att vi kan bli av med en biologisk faktor som påverkar framgången av experiment. Därför i detta system av kvaliteten på ägg som erhållits från PMSG-primade grodor är en viktig biologisk faktor som är avgörande för framgångsrika experiment. Kvaliteten på oocyter kan bedömas efter insamling av äggstockar eller efter defolliculation. Om något onormalt observeras vid dessa stadier, är det optimalt att samla annan äggstock från en ny groda. En annan punkt när du kan kontrollera äggcellen kvalitet är efter oocytmognad. Om mindre än 80% av progesterone-behandlade oocyter visar tecken på mognad, kanske du inte kunna få det tillräckligt antal embryon för ytterligare analyser. Användningen av enzymatisk defolliculation istället för manuell defolliculation är också en annan fördel med att använda detta system för att minska arbete som krävs för defolliculation. Det är emellertid fortfarande möjligt att manuell defolliculation kan ge en bättre utveckling än den enzymatiska behandlingen.
Såsom visas i fig 3, nästan 10% av in vitro-mognade oocyter kan nå simning yngelstadiet. Dessa uppgifter samlas in från 13 oberoende experiment inklusive de som rapporterats i åtta och nya injektionsexperiment. Värdöverföringsmetod behöver 75-150 ägg i varje behandling för att erhålla meningsfulla uppgifter sedan 30-60% av de överförda oocyter kan nå neurula stadiet 17. Vår metod börjar normalt med 200-300 ägg i varje försöksgrupp sedan ca 40-60% av kluvna embryon kan nåmuskelsvar skede. Dessa data tyder på att båda metoderna stödjer en rimlig utvecklingstakt. Hittills har vi fått 10 levande grodor från kontroll mRNA-injicerade och kontroll antisens oligo-injicerade oocyter som använder denna teknik, vilket tyder på att detta tillvägagångssätt stödjer utveckling genom metamorfos.
Vår äggcellen manipulation-ICSI-metoden ger en möjlighet att testa rollen av moderns faktorer under mycket tidig embryonal utveckling, strax efter befruktningen. Dessutom kan överuttryck av kromatin modifierande faktorer innan befruktningen gör det möjligt att omforma mödra kromatin innan befruktning för att förstå moderns kromatin stater som är nödvändiga för utveckling. Denna strategi kan också fungera bra med aktuella genen redigeringssystem såsom transkription aktivator liknande effektor nukleas (Talen) 18,19 och CRISPR / CAS9 20,21 eftersom dessa kan uttryckas med innan befruktningen. Därför har vår nya strategi en potential som skall användas för många tillämpningar i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Gurdon laboratory members for useful discussion. K.M. is a Research Fellow at Wolfson College and is supported by the Herchel Smith Postdoctoral Fellowship and the Great Britain Sasakawa Foundation. Gurdon laboratory is supported by grants from the Wellcome Trust (RG69899) and MRC to J.B.G.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | MSD Animal Health | Vm 01708/4309 | PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222) | Sigma | A5040 | For anesthesia |
Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | For oocyte defolliculation. Store at -20oC |
Drummond Nanoject | Drummond Scientific Company | 3-000-205/206 | For microinjection |
glass capillary | Alpha laboratories | 7” Drummond #3-000-203-G/XL | For microinjection |
Micropipette Puller | SUTTER Instrument | Model D-97 | For microinjection |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | For invitro maturation and ICSI |
14 ml ultra-clear centrifuge tube | Beckman Coulter United Kingdom Ltd | 344060 | For sperm purification |
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol) | Sigma | D1556 | For sperm purification |
Digitonin | Sigma | D141 | Cell permeabilization reagent |
Shaker | Hybaid | HB-SHK-1 | For oocyte defolliculation. |
Dissecting microscope (Stereo zoom microscope) | ZEISS | Semi SV6 | For oocyte collection and microinjection |
50 μm pore filter | CellTrics | 04-0042-2317 | For sperm purification |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100XP | For sperm purification |
50 ml centrifuge tube | Cellstar Greiner Bio-One | 227261 or 210261 | Oocyte collection and defolliculation reaction |
15 ml centrifuge tube | FALCON | 352097 | For sperm purification |
90 mm Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20/C | |
Easy-Grip Cell Culture Dish, 60×15 mm | FALCON | 353004 | |
Easy-Grip Cell Culture Dish, 35×15 mm | FALCON | 351008 |