Method Article

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

DOI:

10.3791/52504

⸱

February 1st, 2015

 ,  ,  , 
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
세이프 하버 AAVS1 유전자 자리에서

TALEN 매개 유전자 편집을 통해 인간 iPSC에서 고효율 전이유전자 추가가 가능합니다. 이 프로토콜은 TALEN 및 donor vector 전달을 위해 iPSC를 준비하고, iPSC를 transfection하고, iPSC 클론을 선택 및 분리하여 GFP 유전자의 표적 통합을 달성하여 리포터 라인을 생성하는 절차를 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

targeted transgene addition은 바이러스 벡터 매개 무작위 통합으로 인한 유전자 침묵 및 삽입 돌연변이 유발을 우회하면서 지속적인 유전자 발현을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 검증된 오픈 소스 TALEN과 유전자 트랩과 같은 공여체를 활용하여 이식유전자를 세이프 하버 유전자 자리로 전달하는 것을 기반으로 인간 iPSC에서 보편적이고 효율적인 이식유전자 표적 추가 플랫폼을 설명합니다. 중요한 것은 효과적인 유전자 편집이 유전자 편집 벡터의 전달 효율성에 의해 속도가 제한된다는 것입니다. 따라서 이 프로토콜은 먼저 높은 핵 전달 효율을 달성하기 위해 transfection을 위한 iPSC를 준비하는 데 중점을 둡니다. 부드러운 세포 해리 시약을 사용하여 iPSC를 단일 세포로 해리하고 최적화된 프로그램을 사용하여 transfection하면 >50%의 세포가 큰 유전자 편집 벡터를 흡수하도록 유도할 수 있습니다. AAVS1 자리는 활성 유전자(PPP1R12C)의 인트론에 위치하기 때문에 스플라이싱 수용체(SA) 연계 퓨로마이신 저항성 유전자(PAC)를 사용하여 무작위 통합 전용 및 transfection되지 않은 세포를 제외하고 표적 iPSC를 선택했습니다. 이 전략은 표적 클론을 얻을 가능성을 크게 증가시키며 다른 활성 유전자 표적화 실험에도 사용할 수 있습니다. 특정 iPSC 라인에 맞게 조정된 용량에서 퓨로마이신을 선별한 지 2주 후, 클론은 크고 분리된 콜로니를 더 작은 조각으로 수동 해부하여 추가 확장 및 유전적 및 기능적 스크리닝을 위해 더 작은 웰에서 새로운 배지로 옮겨 선별할 준비가 됩니다. 이 프로토콜을 따라서 생체 내 및 체외 이미징 및 세포 분리에 유용한 여러 GFP 리포터 iPSC 라인을 쉽게 얻을 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

배아 줄기 세포와 유사한 유도 만능 줄기 세포로 (iPSCs)를 인간의 체세포를 재 프로그램 할 수있는 기능이 처음 다카하시 등에 의해 발견되었다. 2007 1. 레트로 바이러스는 네 개의 전사 인자를 발현하는 형질 도입 인간 피부 섬유 아세포 (소위 불리는 야마나카는 OCT3 요인 / 4, SOX2, C-Myc와, 그리고 Klf4)는 형태, 증식, 유전자 발현 및 후생 유전 학적 상태에 따라 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기)에 매우 유사한 것으로 나타났다; 결정적 iPSCs 또한 모든 세 배엽 (1)의 세포로 분화 할 수있다. iPSCs의 증식 잠재력과 차별화 용량은 그들에게 매우 매력적인 도구를 만드는; 특정 질병을 앓고있는 환자로부터 세포를 재 프로그래밍함으로써 iPSCs 체외 질병 모델 시스템과 같은 잠재적 치료제로서 모두 사용될 수있다.

후자의 목적을 위해, 몇 가지 문제 iPSCs의 잠재력하기 전에 해결해야임상 환경에서 실현 될 수있다; 시험 관내 배양 된 인간 배아 줄기 및 iPSCs, 리 프로그래밍 및 세포 유지하는 동안 이종 유도체의 사용의 발암 가능성, 및 생체 내에서 이식 된 세포를 추적 할 <....

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Protocol

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1. 지하실 막 매트릭스의 준비 및 plasticware에의 코팅

  1. 얼음에 -20 ° C에서 냉동 기저막 매트릭스 스톡을 넣고 4 ℃에서 밤새 해동.
  2. 해동 후, 미리 차게 에펜 도르프 튜브에 기저막 매트릭스의 피펫 2 mg을 분취. 필요할 때까지 -20 ° C에서 이러한 보관하십시오.
  3. , 기저막 매트릭스 코팅 된 플레이트를 준비 에펜 도르프 튜브 사라 얼음의 마지막 조각 (보통 2 ~ 내 시간)까지 얼음에 하나 나누어 해동합니다.
  4. 해동 후, 기저막 매트릭스 코팅 용액을 차가운 (5 ° C) DMEM / F12 12 ml의 기저막 매트릭스를 추가한다.
  5. 적절한 배양 용기에 기저막 매트릭스 솔루션을 추가한다. 6 잘 플레이트를 들어, 잘 당 1 ml의 분배. 기저막 매트릭스 솔루션은 완전하게 잘 다루고 있는지 확인하기 위해 판을 소용돌이.
  6. 파라 필름은 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시를 밀봉하고, 루 부화사용하기 전에 1 시간 동안 m 온도. 또한, 매장 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 4 ° C에서 요리와 코팅 2 주 이내에 사용한다.
    참고 : 건조를 방지하기 위해 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시에 추가 DMEM / F12를 추가합니다. 39 ° C 보관 기저막....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜의 시각화는 iPSCs가 NutriStem에 대한 하나 E8 녹색 또는 청색에 의해 강조 다른 배지에서 배양있는 기간으로, 그림 2에서 제공됩니다. 그것은 단지 고품질 iPSCs를 형질 것이 중요하다; 일상적인 유지 보수 전반에 걸쳐 배양 접시를 검토하고 IPSC 문화는 조약돌 모양의 형태를 베어링 주로 별개의 식민지 (그림 3A)가 들어 있는지 확인; 분화 세포는 배양의 10 % 이상을 점유 안된다. iPSCs의 Transfectability 인해 작은 크기로 전형적으로 달성 가능한 최대의 효율을 나타낸다 PMAX-GFP로 형질 감염 작은 PMAX-GFP 벡터 (도 4A-B)를 사용하여 평가 및 최적화된다. 예를 들어, 우리는 PMAX-GFP (도 4b)로 68.6 %의 형질 전환 효율을 달성 하였다. AAVS1 안전한 항구를 대상으로 지정하려면, iPSCs는 부드러운 단일 셀 해리 시약을 사용하여.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(1) 효율적으로 형질 전환에 의해 iPSCs에 TALEN 및 기증자 플라스미드를 전달; AAVS1 안전 항구의 성공적인 세대를위한 가장 중요한 단계는 인간의 iPSCs가되는 대상 (2) 형질 전환 후 형질 전환 및 도금 밀도 전에 단일 세포로 iPSCs의 분리를 최적화; (3) 투여 량 및 IPSC 라인의 성장에 기초한 약물 - 선택 시간을 최적화; (4)주의 깊게 해부 및 대상 식민지를 따기와 / 웰 새 접시에 전송. Hockemeyer의 용지 (10)에 사용 된 유사한 방법에 비해,이 프로토콜에서 사용 iPSCs의 수를 줄이는 데 도움이 오픈 소스 AAVS1-TALENs 쌍 상이한 IPSC 해리 시약과, TALENs 및 도너 벡터를 제공하는 다른 형질 전환 장치를 사용 실험 높은 형질 전환을 달성하고 효율성을 대상으로한다.

인간 iPSCs에서 고효율 유전자 편집을 달성하기 위해, 제 EDI 유전자의 전달을 최적화하기 위해 필수적급성 세포 사멸에게 전달.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립 관절염, 근골격계 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases)의 NIH Common Fund and Intramural Research Program의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 mlCorning354230-20°C에서 보관.
DMEM/F-12Life Technologies11320-033Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC 처리 다중 웰 플레이트Corning3506
Essential 8 MediumLife TechnologiesA1517001기저 매체를 4 °C에 저장하고 보충제를 -20 °C에 저장합니다.
Y-27632 이염산염Tocris1254실온에서 보관하십시오. H2O에 용해되면 -20°C에서 보관하십시오.
염화나트륨시그마S5886-500G
울트라퓨어 0.5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Life Technologies14190-250
100 mm TC-Treated Culture DishCorning430167
DR4 MEF 2M IRR - AcademicGlobalStemGSC-6204G액체 질소에 보관하십시오.
DMEM, 고포도당, 피루브산Life Technologies11995-0404 °C에 저장.
정의된 소 태아 혈청, 미국 원산지HyCloneSH30070.03-20에서 보관 °C. 4에서 해동 ° C 하룻밤 및 분취. 부분 표본을 -20 °에 저장하십시오. C는 필요할 때까지.
MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)Life Technologies11140-0504 °C에 저장.
4D-Nucleofector 코어 유닛 LonzaAAF-1001B는 전기천공법 시스템
4D-Nucleofector X 유닛의 일부입니다 LonzaAAF-1001X전기천공법 시스템의 일부
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)LonzaV4XP-3024도착 시 Primary Cell Solution을 제거하고 보충하고 4°C에서 보관하십시오.
StemPro Accutase 세포 해리 시약Life TechnologiesA1110501-20 °C에서 보관.4°에서 밤새 해동; C 및 37 °에서 부분 표본을 따뜻하게하십시오. C 사용 전 수조.
NutriStem XF/FF 배양 배지줄기01-0005-20에서 보관 °C. 4에서 하룻밤 해동 ° C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 및 pZT-AAVS1-R1)Addgene52637 및 52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donorAddgene22212
Puromycin DihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Store at -20 °C. ddH2O에서 1mg/ml의 작업 분취액을 준비합니다.
일회용 보로실리케이트 유리 파스퇴르 피펫피셔 사이언티픽13-678-20A
Sorvall Legend XTR (냉장), 120 V 60 HzThermo Scientific75-004-521
TX-750 4 × 750 ml 스윙 버킷 로터Thermo Scientific75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%Life Technologies15250-061

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotec....

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Human iPSCsTALEN TargetingAAVS1 Safe HarborNucleofection TransfectionPuromycin SelectionColony PickingGFP Reporter ExpressionFlow Cytometry AnalysisImmunofluorescence MicroscopyE8 Medium Culture

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