Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

Summary

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Abstract

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

Introduction

La possibilità di riprogrammare le cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte cellule simil-staminali embrionali (iPSCs) fu scoperto da Takahashi et al., Nel 2007 ^1. Fibroblasti dermici umani trasdotte con retrovirus che esprime quattro fattori di trascrizione (Il Yamanaka così soprannominato Fattori Oct3 / 4, Sox2, c-Myc e Klf4) hanno mostrato di essere molto simili alle cellule staminali embrionali umane (hESC) basati sulla morfologia, la proliferazione, l'espressione genica, e lo stato epigenetico; cruciale, iPSCs sono anche in grado di differenziarsi in cellule di tutti e tre i foglietti embrionali ^1. Il potenziale proliferativo e la differenziazione della capacità di iPSCs li rende strumenti molto interessanti; riprogrammando cellule di pazienti affetti da malattie specifiche, iPSCs possono essere utilizzati sia come sistemi modello in vitro di malattia e come potenziali terapie.

Per quest'ultimo scopo, diverse questioni devono essere affrontate prima che il pieno potenziale di iPSCsin un ambiente clinico può essere realizzato; il potenziale oncogeno di hESC coltivate in vitro e iPSCs, l'uso di derivati ​​xenogeniche durante la riprogrammazione e la manutenzione delle cellule, e la necessità di tenere traccia di cellule trapiantate in vivo sono tutti ostacoli cruciali per l'applicazione clinica delle cellule staminali pluripotenti (Inviato da Hentze et al. ^2). Una soluzione ideale per la necessità di monitoraggio cellule differenziate post-trapianto comporterebbe un marcatore visivamente rilevabile che resiste tacere e variegatura indipendentemente dall'applicazione. Espressione robusta e sostenuta di transgeni integrati è più facilmente realizzabile quando il DNA esogeno viene introdotto in porto sicuro loci; cioè, i siti genomici che consentono sufficienti trascrizione di un vettore integrato mentre allo stesso tempo mitigare perturbazioni di espressione in geni vicini ^3. Uno di questi siti che è stato molto ben caratterizzati dalla sua scoperta è il virus integr adeno-associatosito zione 1 (AAVS1), nel primo introne della proteina fosfatasi 1 subunità 12C regolamentazione (PPP1R12C) gene. Questo locus è stato dimostrato non solo di permettere sostenuta e robusta espressione dei transgeni integrati attraverso il tempo prolungato nella cultura e nella differenziazione vitro ^3, ma anche per proteggere i geni di perturbazione trascrizionale ⁴ circostante; entrambe le funzioni si pensa sia dovuto alla presenza di elementi endogeni isolante cromatina che fiancheggiano il sito AAVS1 ^5.

Advances in strumenti di ingegneria del genoma sul proprio nell'ultimo decennio hanno notevolmente facilitato la facilità e l'efficienza con cui le manipolazioni genetiche in qualsiasi tipo di cellula possono essere raggiunti. Mentre i primi esperimenti riusciti invocati estremamente bassi livelli di endogena ricombinazione omologa (HR) con un donatore introdotte per ottenere gene targeting in CES ^6,7, l'uso di nucleasi sito-specifiche, quali nucleasi dita di zinco (ZFNs), che signi, significativamente indurre ricombinazione omologa attraverso la generazione di un doppio filamento rottura del DNA ha notevolmente aumentato l'efficienza di tali esperimenti ^8,9. La riproposizione di entrambi trascrizione attivatore come effettori (racconti) di pianta patogeno xanthomonas generi e le procariote cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) Sistema / Cas9 in efficienti nucleasi progettista site specific ha fatto gene targeting nelle cellule staminali pluripotenti un accessibile e metodologia possibile ^10-13.

Un recente ha descritto un metodo efficace per l'integrazione stabile di una cassetta reporter fluorescente verde nel AAVS1 porto sicuro locus in iPSCs umani con nucleasi Tale (Talens) ^14. Questi iPSCs mirati hanno mantenuto la loro fluorescenza, anche dopo la differenziazione diretta a cardiomiociti e il trapianto in un modello murino di infarto del miocardio (MI), che fornisce una forte evidenza per l'utilità di talestabilmente pluripotenti fluorescente cellule staminali ^14. Per ottenere colonie mirati, un metodo gene-trap è stato usato cui un splicing-accettore (SA), 2A sequenza peptidica auto-scissione colloca la puromicina N-acetil-transferasi (PAC) gene sotto il controllo del promotore PPP1R12C endogena; quindi, solo iPSCs che hanno incorporato il donatore DNA a livello del locus AAVS1 esprimono PAC, rendendoli selezionabili in base puromicina-resistenza; (Figura 1, ^15). Dettagli Questo protocollo le procedure di generare AAVS1-GFP iPSCs segnalato nel recente documento ^14, tra cui il processo di trasfettando iPSCs con Talens e 9,8 kb donatori di integrare un frammento di 4.2kb DNA nel locus AAVS1 porto sicuro, selezionando iPSCs basati su puromicina-resistenza, e le colonie di prelievo per l'espansione clonale. Le tecniche qui descritte possono essere applicate a vari esperimenti di ingegneria genoma.

Protocol

1. Preparazione della matrice di membrana basale e rivestimento dei Plasticware Posizionare il congelato membrana basale matrice magazzino da -20 ° C su ghiaccio e scongelare una notte a 4 ° C. Dopo lo scongelamento, pipetta 2 mg aliquote di matrice membrana basale in tubi Eppendorf pre-refrigerati. Conservare questi a -20 ° C fino al momento dell'uso. Per preparare piatti matrice rivestite membrana basale, scongelare un'aliquota sul ghiaccio fino a quando l'ultimo pezzo di …

Representative Results

Una visualizzazione del protocollo è fornita in figura 2, con i periodi durante i quali iPSCs sono coltivate in mezzo diverso evidenziata da una verde per E8 o blu per NutriStem. E 'importante per trasfettare solo iPSCs di alta qualità; esaminare piatti della cultura in tutta la manutenzione ordinaria e verificare che le culture IPSC contengono colonie principalmente distinti recanti una morfologia ciottoli-simile (Figura 3A); cellule differenziate non dovrebbe occupare più del 1…

Discussion

Le fasi più critiche per il successo generazione di AAVS1 esente mirati iPSCs umani sono: (1) efficiente di Talen e donatori plasmidi in iPSCs by trasfezione; (2) ottimizzare dissociazione di iPSCs nelle singole cellule prima trasfezione e placcatura densità dopo trasfezione; (3) ottimizzare dose ed il tempo di farmaco-selezione basata sulla crescita della linea COPSI; (4) dissezionare con cura e raccolta colonie mirate e trasferimento alla nuova piastra / bene. Rispetto ai metodi simili impiegati per la carta di Hock…

Materials

NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT	COMPANY	CATALOG #	COMMENTS/DESCRIPTION
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL	Corning	354230	Store at -20°C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4°C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR – Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4°C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061