Genekspresjon analyse av et undersett av celler i et bestemt vev er en stor utfordring. Denne artikkelen beskriver hvordan du isolerer høy kvalitet total RNA fra en bestemt celle befolkning ved å kombinere en rask immunolabeling metode med laser capture mikrodisseksjon.
Laser fangst mikrodisseksjon (LCM) tillater isolering av bestemte celler fra tynne vevssnitt med høy romlig oppløsning. Effektiv LCM krever nøyaktig identifikasjon av celler subpopulasjoner fra et heterogent vev. Identifikasjon av celler av interesse for LCM er vanligvis basert på morfologiske kriterier eller på fluorescerende protein journalister. Kombinasjonen av LCM og hurtig immunolabeling tilbyr en alternativ og effektiv måte for å visualisere spesifikke celletyper, og for å isolere dem fra omgivende vev. Høy kvalitet RNA kan deretter tas ut fra en ren cellepopulasjon og bearbeides videre for nedstrøms applikasjoner, inkludert RNA-sekvensering, microarray eller QRT-PCR. Denne tilnærmingen har tidligere blitt utført og kort beskrevet i noen publikasjoner. Målet med denne artikkelen er å illustrere hvordan du utfører rask immunolabeling av en cellepopulasjon samtidig RNA integritet, og hvordan å isolere disse spesifikke celler ved hjelp LCM. Her, vi illustrered denne multi-trinns prosedyre ved immunolabeling og fange dopaminerge celler i hjernevev fra en-dag-gamle mus. Vi markere viktige kritiske trinn som fortjener spesiell vurdering. Denne protokollen kan tilpasses til en rekke forskjellige vev og celler av interesse. Forskere fra ulike felt vil trolig ha nytte av demonstrasjonen av denne tilnærmingen.
Hjernen består av et stort utvalg av forskjellige typer nevroner som danner komplekse nettverk. Disse nevronene er organisert i forskjellige grupper og undergrupper i henhold til deres morfologi, tilkoblingsmuligheter og genuttrykk mønster 1. Utviklingen av mikromatriser, neste generasjons sekvensering, og QRT-PCR tilbudt muligheten til å sammenligne genekspresjonsprofiler av nevronale populasjoner i ulike biologiske sammenhenger 1,2. Disse sensitive analyser krever presis identifisering og isolering av celletyper av interesse mens du holder RNA integritet 2-4. Fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) teknikken har blitt mye brukt for å isolere spesifikke celletyper basert på celleoverflatemarkører og / eller morfologi. FACS krever en celle dissosiasjon trinn før sortering, noe som resulterer i et fullstendig tap av romlig oppløsning 5. Mange neuronal subpopulasjoner skiller seg fra hverandre i henhold til sin anatomiske fordeling i the hjernen. Laser capture mikrodisseksjon brukes på tynne hjerne seksjoner gir et passende alternativ for spesifikke isolering av celler med høy romlig oppløsning 6-8. En større begrensning av LCM har vært behovet for å identifisere celler av interesse basert på morfologiske kriterier eller fluorescerende protein reportere genetisk konstruert i dyremodeller. Utvikling av nye teknikker for å utføre raske immunolabeling metoder som bevarte RNA integritet, i kombinasjon med LCM, tillater nå isolering av celleunderpopulasjoner for å fortsette med gen-profilering eksperimenter.
Denne tilnærmingen har tidligere blitt utført og kort beskrevet i noen publikasjoner 1,9-13. Her viser vi en detaljert prosedyre for å oppnå høy kvalitet på RNA fra en spesifikk undergruppe av celler i en kompleks struktur vev ved å kombinere rask immunolabeling med LCM. Vi viser hvordan du utfører viktige kritiske trinn for å oppnå maksimal RNA utvinning og unngå RNA degradering som det kan significantly innvirkning genuttrykk profilering.
For demonstrasjon av denne protokollen, ble dopaminerge nevroner fra en-dags-gamle musehjernen målrettet. Dopaminerge neuroner kan immunolabeled ved hjelp av et antistoff rettet mot tyrosin hydroksylase (TH), det hastighetsbegrensende enzym for dopamin-syntese. Etter TH farging, kan enkeltpersoner eller grupper av dopaminerge nevroner så isoleres ved hjelp av LCM. Microdissected celler er samlet i lyseringsbuffer, og RNA ble ekstrahert ved anvendelse av en RNA-isolering kit. Kvalitet og kvantitet av ekstrahert RNA måles ved hjelp av en Bioanalyzer 5. Videre analyse av genuttrykk ved bruk av: RNA sekvensering, microarray, eller QRT-PCR kan deretter utføres 2,4,6. Som et eksempel, er en to-trinns QRT-PCR demonstrert på laser fanget isolert dopaminerge domener. Relativ kvantifisering av uttrykk nivåer av to dopaminerge nevroner markørgener illustrerer selektivitet av denne protokollen.
Den mest kritiske punkt ved denne metode består i merking av celler av interesse, mens hindrer RNA-degradering. Som RNaser er aktive i vandige oppløsninger, mink inkubasjonstider forbedrer RNA bevaring 11,15. Alle løsninger som brukes må behandles med DEPC å inaktivere RNases. Alle materialer og overflater trenger å bli behandlet med et overflate RNAse dekontaminering løsning for å hindre forurensning RNaser. Til slutt, i disse forhold, er tilsetning av RNAse inhibitoren i alle løsningene effektive i…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
Ethanol absolute | |||
Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |