RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Summary

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

Abstract

Lasermicrodissectie (LCM) kan de isolatie van specifieke cellen uit dunne coupes met een hoge ruimtelijke resolutie. Effectieve LCM vereist een nauwkeurige identificatie van cellen subpopulaties uit een heterogene weefsel. Identificatie van cellen van belang voor LCM is gewoonlijk gebaseerd op morfologische criteria of fluorescerend eiwit reporters. De combinatie van LCM en snelle immunokleuring biedt een alternatieve en efficiënte manier om specifieke celtypen te visualiseren en te isoleren van de omringende weefsels. Hoogwaardige RNA kan vervolgens worden geëxtraheerd uit een zuivere celpopulatie en verder verwerkt voor stroomafwaartse toepassingen, waaronder RNA-sequencing, microarray of qRT-PCR. Deze benadering is eerder uitgevoerd en kort beschreven in enkele publicaties. Het doel van dit artikel is om te illustreren hoe snel immunolabeling van een cel populatie uit te voeren terwijl het houden van RNA integriteit, en hoe deze specifieke cellen met behulp van LCM isoleren. Hierin, we illustrerend deze multi-step procedure immunokleuring en vastleggen van dopaminerge cellen in hersenweefsel van één dag oude muizen. We belichten de belangrijkste kritische stappen die speciale aandacht verdienen. Dit protocol kan worden aangepast aan een verscheidenheid van weefsels en cellen van belang. Onderzoekers uit verschillende disciplines zullen waarschijnlijk profiteren van de demonstratie van deze aanpak.

Introduction

De hersenen bestaan ​​uit een grote verscheidenheid van verschillende typen neuronen vormen complexe netwerken. Deze neuronen zijn georganiseerd in verschillende groepen en subgroepen aan hun morfologie, connectiviteit en genexpressie patroon ^1. De ontwikkeling van microarrays, next-generation sequencing, en qRT-PCR de mogelijkheid geboden om de genexpressie profielen van neuronale populatie te vergelijken in verschillende biologische contexten ^1,2. Deze gevoelige analyses vereisen de precieze identificatie en isolatie van celtypen van belang terwijl RNA integriteit ^2-4. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) techniek wordt veel gebruikt om specifieke celtypen basis van celoppervlak markers en / of morfologie isoleren. FACS is een cel dissociatie stap voor het sorteren, hetgeen resulteert in een volledig verlies van ruimtelijke resolutie ^5. Vele neuronale subpopulaties van elkaar onderscheiden volgens hun anatomische verdeling the hersenen. Lasermicrodissectie toegepast op dunne hersensecties biedt een geschikte optie voor specifieke isolatie van cellen met een hoge ruimtelijke resolutie ^6-8. Een belangrijke beperking van LCM is de noodzaak cellen van belang op basis van morfologische criteria of fluorescent proteïne reporters genetisch in diermodellen identificeren. De ontwikkeling van nieuwe technieken om snel immunokleuring methoden RNA integriteit behouden, in combinatie met LCM voeren, laat nu de isolatie van cel subpopulaties te gaan met gen-profiling experimenten.

Deze aanpak is al eerder uitgevoerd en kort beschreven in enkele publicaties ^1,9-13. Hier tonen we een gedetailleerde procedure hoogwaardige RNA te verkrijgen van een specifieke subset van cellen in een complex weefselstructuur door het combineren snel immunokleuring met LCM. We laten zien hoe u de belangrijkste kritische stappen uit te voeren om maximale RNA herstel te verkrijgen en te voorkomen dat RNA degradatie als het kan sigdend effect genexpressie profilering.

Voor de demonstratie van dit protocol, werden dopaminerge neuronen van de ene dag oud muis middenhersenen gericht. Dopaminerge neuronen kunnen immunologisch met een antilichaam gericht tegen tyrosine hydroxylase (TH), de snelheidsbeperkende enzym dopamine synthese. Volgende TH immunostaining, individuele of groepen van dopaminerge neuronen kan vervolgens geïsoleerd worden met behulp van LCM. Gemicrodisseceerde cellen worden verzameld in de lysis buffer en RNA geëxtraheerd met behulp van een RNA isolatie kit. Kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerde RNA worden gemeten met behulp van een bioanalyzer ^5. Verdere analyse van genexpressie gebruikmaking RNA sequencing, microarray of qRT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd ^2,4,6. Als voorbeeld wordt een tweestaps qRT-PCR aangetoond op laser gevangen geïsoleerd dopaminerge domeinen. Relatieve kwantificatie van de expressie van twee dopaminerge neuronen marker genen illustreert de selectiviteit van dit protocol.

Protocol

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door het Comité Université Laval Dierenbescherming. 1. Monstervoorbereiding OPMERKING: In dit voorbeeld hebben we gebruikt muizenhersenen bij postnatale dag 1. Gebruik hypothermie anesthesie in gemalen ijs gedurende 3-4 minuten voor pups vervolgens ontleden hersenen zo snel mogelijk in ijskoude L15 med…

Representative Results

Deze snelle immunolabeling procedure maakt visualisatie van cellen van belang terwijl RNA integriteit. Figuur 1 illustreert de stappen van het weefsel voorbereiding voor RNA-extractie. Na cryosectioning worden dopaminerge neuronen gelabeld met een antilichaam gericht tegen de tyrosine hydroxylase (gemerkte neuronen weergegeven in bruin). Afhankelijk van de experimentele betrokken kunnen enkele cellen of groter gebied van belang worden geïsoleerd middels LCM (figuur 1D – E).</st…

Discussion

De meest kritische punt van deze methode bestaat uit het labelen van cellen plaats en voorkomt RNA degradatie. Zoals RNAses zijn actief in waterige oplossingen, de vermindering incubatietijd verbetert RNA behoud ^11,15. Alle gebruikte oplossingen moeten met DEPC tot RNAses inactiveren. Alle materialen en oppervlakken moeten worden behandeld met een oppervlakte RNAse decontaminatie oplossing RNAses verontreiniging te voorkomen. Tenslotte, in deze omstandigheden, de toevoeging van RNAse inhibitor in alle oplossi…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR