בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling
Summary
ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.
Abstract
microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר הבידוד של תאים ספציפיים מסעיפי רקמות דקים עם רזולוציה מרחבית גבוהה. LCM האפקטיבי דורש זיהוי מדויק של תת-אוכלוסיות תאים מרקמות הטרוגנית. זיהוי של תאים בעלי העניין לLCM מבוסס בדרך כלל על קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי. השילוב של LCM וimmunolabeling המהיר מציע אמצעים חלופיים ויעילים כדי להמחיש סוגי תאים מסוימים ולבודד אותם מרקמה הסובבת. RNA באיכות גבוהה אז יכול להיות שחולץ מאוכלוסיית תא טהורה ועיבוד נוסף ליישומים במורד הזרם, כולל RNA-רצף, microarray או qRT-PCR. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש כיצד לבצע immunolabeling המהיר של אוכלוסיית תא, תוך שמירה על שלמות RNA, ואיך לבודד תאים הספציפיים אלה באמצעות LCM. במסמך זה, אנו ממחישיםד הליך רב-שלבים זה על ידי immunolabeling ולכידת תאי דופאמין ברקמת מוח מעכברים ליום אחד-עשר. אנו מדגישים את שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של רקמות ותאים של עניין. חוקרים מתחומים שונים צפויים ליהנות מההפגנה של גישה זו.
Introduction
המוח מורכב ממגוון גדול של סוגים שונים נוירון יוצרים רשתות מורכבות של. נוירונים אלה מאורגנים בקבוצות ותת-קבוצות שונות בהתאם לדפוס מורפולוגיה, הקישוריות וביטוי הגנים שלהם 1. הפיתוח של microarrays, הרצף של הדור הבא, וqRT-PCR הציעו את האפשרות להשוות פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות נוירונים בהקשרים ביולוגיים שונים 1,2. ניתוחים רגישים אלה דורשים זיהוי ובידוד המדויקים של סוגי תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA 2-4. טכניקת פלורסנט הופעלה תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב לבודד את סוגי תאים ספציפיים המבוססים על סמנים על פני קרום תא ו / או מורפולוגיה. FACS דורש צעד ניתוק תא לפני המיון, שתוצאתה אובדן הרזולוציה מרחבית 5 מלא. תת-אוכלוסיות עצביות רבות נבדלות זו מזו על פי ההתפלגות האנטומי שלהם בהמוח אלקטרוני. microdissection ללכוד לייזר מיושם על חלקים במוח דקים מספק אפשרות מתאימה לבידוד ספציפי של תאים עם רזולוציה מרחבית גבוהה 6-8. מגבלה העיקרית של LCM הייתה הצורך לזהות תאים של עניין על פי קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי המהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים. הפיתוח של טכניקות חדשות לביצוע שיטות immunolabeling מהירות שהשתמרו שלמות RNA, בשילוב עם LCM, עכשיו מאפשר הבידוד של אוכלוסיות תאים להמשיך בניסויי פרופיל-גן.
גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים 1,9-13. הנה, אנחנו מדגימים נוהל מפורט להשגת RNA באיכות גבוהה מקבוצת משנה ספציפית של תאים במבנה רקמה מורכב על ידי שילוב של immunolabeling מהיר עם LCM. אנו מראים כיצד לבצע שלבים קריטיים מפתח להשגת התאוששות RNA מקסימאלי ולהימנע משפלת RNA כפי שהוא עשוי sigהפרופיל של התבטאות הגנים השפעת nificantly.
להפגנה של פרוטוקול זה, נוירונים דופאמין מהמוח תיכון עכבר יום אחד-עשר היו ממוקדים. ניתן immunolabeled נוירונים דופאמין באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (TH), אנזים שער הגבלה לסינתזת דופמין. בעקבות immunostaining TH, בודד או קבוצות של נוירונים דופאמין אז יכול להיות מבודדות באמצעות LCM. תאי microdissected נאספים במאגר תמוגה, ו- RNA מופק באמצעות ערכת בידוד RNA. איכות וכמות של RNA שחולץ נמדדות באמצעות bioanalyzer 5. ניתוח נוסף של ביטוי גנים באמצעות: רצף RNA, microarray, או qRT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע 2,4,6. כדוגמא, שני שלבים qRT-PCR בא לידי הביטוי בתחומי דופאמין המבודד הלייזר שנתפס. כימות יחסי של רמות הביטוי של גני סמן נוירון שני דופאמין ממחיש את הסלקטיביות של פרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנקודה של שיטה זו הקריטית ביותר מורכבת בתיוג תאים של עניין תוך מניעת השפלה RNA. כRNAses פעיל בתמיסות מימיות, הפחתת זמני דגירה משפרת שימור RNA 11,15. כל הפתרונות המשמשים צריכים להיות מטופל בDEPC כדי להשבית RNAses. כל החומרים והמשטחים צריכים להיות מטופלים עם פתרון טיהור RNAse פני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
