ההדמיה המקומית Ca^{2 +} אותות בתאי יונקים בתרבית

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Cytosolic Ca ^{2 +} יונים להסדיר היבטים רבים של פעילות סלולרית כמעט בכל סוגי תאים, שליטה תהליכים רחבה היקף כמו שעתוק הגנים, רגישות חשמל וחלוקה של תאים. הגיוון והסגוליות של Ca ^{2 +} איתות נובעים ממנגנונים שבאמצעותם Ca ^{2 +} אותות נוצרים לפעול על סולמות זמן ומרחב שונים, הנעים בין תנודות תא-רחב וגלים המתרחשים על פני תקופות של דקות לCa ^{2 +} microdomains החולף המקומי ^{(2 +} Ca פחזנית) אלפיות שנייה קיימא. התקדמות שחלה באחרונה באלקטרון כפול CCD מצלמות (EMCCD) כעת לאפשר להדמיה של ^{2 +} אותות Ca המקומיים עם רזולוציה מרחבית 128 x 128 פיקסלים בשיעורים של> 500 מסגרות לשנייה ^-1 (fps). גישה זו היא מקבילה מאוד ומאפשרת ניטור סימולטני של מאות ערוצים או אתרי נשיפה בניסוי יחיד. (1 PE Gb בערך עם זאת, הכמויות עצומות של נתונים שנוצרודקות r) להבהיר זיהוי חזותי וניתוח של Ca ^{2 +} אירועים המקומיים מעשי. כאן אנו מתארים ומדגימים את ההליכים לרכישה, האיתור, וניתוח של ה- IP המקומי ₃ בתיווך Ca ^{2 +} אותות בתאי יונקים שלמים עמוסים ^{2 +} אינדיקטורים Ca באמצעות שתי עלית הקרינה רחב בתחום (WF) והשתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRF). יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם שפתח בתוך Python סביבת תוכנת הקוד הפתוח שממכן את זיהוי וניתוח של Ca ^{2 +} אותות המקומיים אלה. אלגוריתם localizes אתרים של Ca ^{2 +} שחרור עם רזולוציה תת-פיקסל; מאפשר סקירת משתמש של נתונים; ופלטי רצפים של אותות יחס הקרינה זמן יחד עם משרעת ונתונים הקינטית בשולחן Excel תואם.

Introduction

יוני סידן (Ca ^{2 +)} בכל מקום להסדיר במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כוללים ביטוי גנים, הפרשה ושינויים ארוכי טווח בפלסטיות הסינפטית ^1. אחת דרכים שבאמצעותו Ca ^{2 +} יכול לפעול באופן שונה היא באמצעות דפוסי מרחב ובזמן השונים של Ca ^{2 +} אותות תא יכול לייצר. לגבה דוגמא העולמיים בcytosolic התכווצות הדק [Ca ^{2 +]} ברקמת שריר חלק ² ואילו קטן יותר, גבהים חולפים מקומיים (Ca ^{2 +} microdomains המקומי) לעורר ביטוי גנים חיוני ללמידה וזיכרון ^3.

cytosolic חינם [Ca ^{2 +]} נשמר במנוחה ~ 100 ננומטר, אבל במהירות יכול לעלות לכמה מיקרו-טוחנת הבאות הזרם של Ca ^{2 +} לcytosol דרך Ca ^{2 +} תעלות יונים -permeable ממוקמות בקרום הפלזמה ועל ידי השחרור של Ca ^{2 +} משל תאיתtores. המעבדה שלנו מתמקדת בקולט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP ₃ R), אשר מהווה ערוץ הפצת Ca ^{2 +} הממוקם בקרום reticulum endoplasmic (ER). על הכריכה של שני IP ₃ וCa ^{2 +} לcytosolic הפעלת אתרים של הקולטן, ערוץ R IP ₃ נפתח לשחרור Ca ^{2 +} מוחרם בתוך לומן ER. שחרורו של Ca ^{2 +} עשוי להישאר מוגבל מרחבית למקבץ קטן של IP ₃ R כדי ליצור microdomain cytosolic מקומי של Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} נשיפה ⁴⁾ או, בהתאם לקרבה של אשכולות הסמוכות של IP ₃ Rs, רשאי להפיץ בכל תא על ידי גיוס אתרי נשיפה מרובים באמצעות תהליך של Ca ^{2 +} -release Ca ^{2 +} -induced (CICR) ^5,6.

ההקדמה של צבעי המחוון ^{2 +} מולקולה קטנה ניאון Ca שפותחה על ידי רוג'ר ⁷ Tsien, בשילוב עם imagi מיקרוסקופיה המתקדמת ng טכניקות, יש להקל באופן משמעותי את ההבנה של Ca ^{2 +} איתות שלנו. התקדמות שחלה באחרונה מצלמות המשמשות למיקרוסקופיה בחברה מאפשרת הדמיה Ca ^{2 +} אירועים מקומיים חולפים כמו פחזנית עם רזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. כיום מצלמות זמינות EMCCD לאפשר הדמיה עם 128 x 128 פיקסלים ב> 500 מסגרות לשנייה ^-1 (fps) והדור החדש של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימות מצלמות (CMOS) מספקות רזולוציה גבוהה יותר פיקסל, ומהירות אפילו מהר יותר על חשבון מעט גבוה יותר רמות רעש. בשיתוף עם מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות פנימית (TIRF) ניתן כיום לתמונה Ca ^{2 +} אחד אירועי ערוץ ^8,9. גישה זו מאפשרת להדמיה של מאות ערוצים / אירועים בו זמנית, תוך יצירת קבוצות גדולות נתונים (בערך 1Gb לדקה) ההופכים את העיבוד ידני, זיהוי חזותי וניתוח מעשי ולמקם את אחריות על הפיתוח של אלגוריתמים אוטומטיים.

<p class = "jove_content"> כאן, אנו מציגים נהלים ופרוטוקולים להדמית Ca ^{2 +} אותות מקומיים בתאי יונקים שלמים באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים ניאון. בנוסף, אנו מראים אלגוריתם שפותח בפייתון סביבת הקוד הפתוח המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של ^{2 +} Ca אירועים המקומיים צילמו על ידי שני TIRF ומיקרוסקופיה עלית הקרינה שדה רחב קונבנציונלית (WF). למרות שאנו מתארים גישות אלה בהקשר של IP ₃ -generated Ca ^{2 +} אותות, הם ניתנים בקלות ללמוד שינויים מקומיים בcytosolic [Ca ^{2 +]} הנובעים ממגוון רחב של Ca ^{2 +} תעלות יונים -permeable ממוקמות באו המשטח קרום או אברונים תוך-תאיים ^8-10.

Protocol

אנו מציגים נהלים מפורטים להדמית Ca 2 + אירועים מקומיים בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה האנושית. ניתן להתאים נהלים אלה ל2+ אותות תאיים תמונת Ca בסוגי תאים רבים 8-10. 1. הכנת תאים ?…

Representative Results

איור 1 א מציג תמונת WF של מנוחה הקרינה קאל-520 בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y האנושיים טעונים גם עם ci-IP 3. חשיפה של תאים אלה לבזק 100 UV msec לתמונה-שחרור i-IP 3 עוררה Ca 2 + פחזניות חולפות באתרים בדידים (שצוין על ידי העיגולים הלבנים באיור 1 א). עקבות הקרינ?…

Discussion

אנו מתארים כאן פרוטוקולי הדמיה Ca ^{2 +} אירועים מקומיים בתאי יונקים בתרבית באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים ניאון. יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של נתונים שנרכשו. ההליך המתואר כאן לנצל את Ca ^{2 +} מחוון ניאון ק?…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C