Imaging Lokale Ca²⁺ Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Cytosolische Ca ²⁺ -ionen reguleren talrijke aspecten van de cellulaire activiteit in bijna alle celtypen, beheersen van processen zo breed als gen-transcriptie, elektrische prikkelbaarheid en celproliferatie. De diversiteit en specificiteit van Ca ²⁺ signalering is afgeleid van mechanismen die Ca2 ⁺ signalen worden gegenereerd om te handelen over verschillende tijd en ruimtelijke schalen, gaande van cel-brede trillingen en golven die zich over de perioden van minuten tot lokale voorbijgaande Ca ²⁺ microdomeinen (Ca ²⁺ pufjes) blijvende milliseconden. Recente ontwikkelingen in de elektron vermenigvuldigd CCD (EMCCD) camera's nu mogelijk voor de beeldvorming van de lokale Ca ²⁺ signalen met een 128 x 128 pixel ruimtelijke resolutie met een snelheid van> 500 frames sec ^-1 (fps). Deze aanpak is zeer parallel en maakt de gelijktijdige bewaking van honderden kanalen of bladerdeeg sites in een enkel experiment. Echter, de enorme hoeveelheden gegevens die worden gegenereerd (ca. 1 Gb per min) maken visuele identificatie en analyse van de lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen onuitvoerbaar. Hier beschrijven we en demonstreren van de procedures voor de verwerving, detectie en analyse van de lokale _{IP-3-gemedieerde} Ca2 ⁺ signalen in intacte zoogdiercellen geladen met Ca ²⁺ indicatoren met behulp van zowel wide-field epi-fluorescentie (WF) en de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Verder beschrijven we een algoritme ontwikkeld binnen de open-source software-omgeving Python dat de identificatie en analyse van deze lokale Ca ²⁺ signalen automatiseert. Het algoritme lokaliseert websites van Ca ²⁺ release met sub-pixel resolutie; kan de gebruiker van de gegevens; en uitgangen tijd sequenties van fluorescentieverhouding signalen samen met amplitude en kinetische gegevens in een Excel-compatibele tafel.

Introduction

Calciumionen (Ca ²⁺⁾ alomtegenwoordig reguleren een divers aanbod van biologische processen, met inbegrip van genexpressie, secretie en langdurige veranderingen in de synaptische plasticiteit ^1. Een manier waardoor Ca ²⁺ kan handelen in zo'n diverse manier is door middel van de verschillende ruimtelijke en temporele patronen van Ca ²⁺ signaleert een cel kan genereren. Bijvoorbeeld wereldwijde verhogingen in cytosolisch [Ca ^2+] trekker contractie van glad spierweefsel ² terwijl kleinere, plaatselijke voorbijgaande verhogingen (lokale Ca ²⁺ microdomeinen) stimuleren genexpressie essentieel voor leren en geheugen ^3.

Vrije cytosolische [Ca ^2+] wordt op ~ 100 nM in rust, maar snel oplopen tot verscheidene micro-molaire na de instroom van Ca2 ⁺ in het cytosol door Ca2 ⁺ -doorlaatbare ionenkanalen in het plasmamembraan en de bevrijding van Ca ²⁺ uit intracellulaire stores. Ons laboratorium richt zich op de inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptor (IP _3R) dat een Ca2 ⁺ afgifte kanaal in het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan vormt. Na binding van beide _IP-3 en Ca ²⁺ naar het cytosol activeren van websites van de receptor, de IP ₃ R-kanaal opent bevrijden Ca ²⁺ afgezonderd binnen het ER lumen. De afgifte van Ca2 ⁺ kan ruimtelijk beperkt blijven tot een klein cluster van _IP3 Rs een lokale microdomein cytosolische Ca ²⁺ genereren (Ca2 ⁺ bladerdeeg ⁴⁾ of, afhankelijk van de nabijheid van naburige clusters van _IP3 Rs, kan propageren gedurende een cel door het aantrekken van meerdere bladerdeeg sites door middel van een proces van Ca ²⁺ geïnduceerde Ca ²⁺ -release (CKP) ^5,6.

De invoering van fluorescerende klein molecuul Ca ²⁺ indicatorkleurstoffen ontwikkeld door Roger Tsien ^7, in combinatie met geavanceerde microscopie Imaging technieken sterk vergemakkelijkt ons begrip van Ca2 ⁺ signalering. Recente ontwikkelingen in de camera's gebruikt voor microscopie nu toe voor de beeldvorming van voorbijgaande lokale Ca ²⁺ evenementen zoals soesjes met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Momenteel beschikbare EMCCD camera mogelijk beeldvorming met 128 x 128 pixels bij> 500 frames sec ^-1 (fps) en de nieuwe generatie Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) camera's hogere pixelresolutie, en zelfs hogere snelheid ten koste van iets hoger geluidsniveaus. In combinatie met de totale interne reflectie (TIRF) microscopie is het nu mogelijk om het beeld enkele Ca ²⁺ kanaal gebeurtenissen ^8,9. Deze benadering maakt de beeldvorming van honderden kanalen / gebeurtenissen gelijktijdig, terwijl het genereren van grote datasets (ca. 1 GB per minuut) dat automatische verwerking visuele identificatie en analyse onuitvoerbaar maken en plaats een last op de ontwikkeling van geautomatiseerde algoritmen.

<p class = "jove_content"> Hier presenteren we procedures en protocollen voor het afbeelden lokale Ca2 ⁺ signalen in intacte zoogdiercellen behulp van fluorescente Ca2 ⁺ indicatoren. We verder aan te tonen een algoritme ontwikkeld in de open-source omgeving Python dat identificatie en analyse van de lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen afgebeeld door zowel TIRF en conventionele brede veld epi-fluorescentie (WF) microscopie automatiseert. Hoewel we beschrijven deze benaderingen in de context van _IP3 -generated Ca2 ⁺ signalen, die zich gemakkelijk lenen om lokale wijzigingen in cytosolisch [Ca ^2+] afkomstig van verschillende Ca2 ⁺ -doorlaatbare ionenkanalen in ofwel de oppervlaktestudie membraan of intracellulaire organellen ^8-10.

Protocol

We presenteren gedetailleerde procedures voor de beeldvorming van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen in de menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen. Deze procedures kunnen worden aangepast aan het intracellulaire Ca2 + signalen in veel celtypen 8-10. 1. Bereiding van Cellen De cultuur van de cellen af ​​te beelden volgens de instructies vermeld op de website van hun leverancier. Een paar dagen voor beeldvorming, oogsten cellen gekweekt in …

Representative Results

Figuur 1A toont een WF beeld van rust Cal-520 fluorescentie in menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen ook geladen met ci-IP-3. Blootstelling van deze cellen om een 100 msec UV flits van de foto-versie i-IP 3 uitgelokt voorbijgaande Ca 2+ soesjes op discrete sites (opgemerkt door de witte cirkels in figuur 1A). Fluorescentie sporen gemeten in situ vond snelle stijgende fase wegens tijdelijke openingen van IP3 Rs, gevolgd door een veel langzame…

Discussion

We beschrijven hier protocollen voor de beeldvorming van de lokale Ca ²⁺ gebeurtenissen in gekweekte zoogdiercellen met fluorescerende Ca ²⁺ indicatoren. Verder beschrijven we een algoritme met een intuïtieve gebruikersinterface die de identificatie en analyse van de verkregen data automatiseert. De hier beschreven procedure gebruik maken van de fluorescerende Ca ²⁺ indicator Cal-520, maar veel andere Ca ²⁺ gevoelige kleurstoffen zoals Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 en Oregon Green B…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C