바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis⁸⁹ ZR-DFO 표지 항체

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

항체의 탁월한 친화력, 특이도, 선택은 그들에게 종양을 대상으로 PET 방사성 의약품에 대한 매우 매력적인 벡터를 확인합니다. 으로 인해 여러 날 생물학적 반감기, 항체는 비교적 긴 물리적 붕괴 반감기 양전자 방출 방사성 핵종으로 표시해야합니다. 전통적으로, 양전자 방출 동위 원소 ^(124)는 I (t _1/2 = 4.18 D), ⁽⁸⁶⁾ Y (t _1/2 = 14.7 시간), ⁶⁴ 구리 (t _1/2 = 12.7 시간)은 대한 항체를 라벨 사용되어왔다 PET 영상. 그러나 최근 필드는 항체 기반 PET 이미징 에이전트에 양전자 방출 방사성 ⁸⁹ ZR의 사용이 크게 증가를 목격 하였다. 그것이 물리적 반을 가지고 ⁸⁹ ZR은 면역 접합체와 PET 이미징에 대한 거의 이상적인 방사성 동위 원소 인 항체의 생체 내 약물 동태와 호환되며 상대적으로 낮은 에너지를 방출 – 생활 (t _1/2 = 78.4 시간)고해상도 이미지를 생성 RGY의 양전자. 또한, 항체는 노골적 시데로 포어 파생 킬레이트 desferrioxamine (DFO)를 사용하여 ⁸⁹ ZR으로 표시 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체, (2) radiosynthesis 및 ⁸⁹ Zr-의 정제 – 이소 티오 시아 네이트 DFO 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션 암의 뮤린 모델 ^ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate와-DFO 단클론 radioimmunoconjugate, 및 (3) 생체 내 PET 영상화.

Introduction

인해 현저한 감도, 친화력 및 선택성으로, 항체는 긴 암 세포에 방사선 동위 원소의 전달을 위해 유망 벡터를 고려되었다. 그러나, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상에의 응용들은 표지 용 적당한 양전자 방출 동위 원소의 부족에 의해 방해되어왔다. radioimmunoconjugates의 설계에서 가장 중요한 고려 사항 중 ^1-3 하나의 물리적 붕괴 매칭되는 하프 항체의 생체 내 약물 동태에 방사성 동위 원소의 생활. 보다 구체적으로, 항체는 종종 비교적 긴 멀티 일 생물학적 반감기를 가지므로 비교 물리적 반감기의 방사성 동위 원소로 표지되어야한다. PET 영상 응용 프로그램의 경우, 항체는 전통적으로 ⁽⁶⁴⁾ 구리 (t _1/2 = 12.7 시간), ⁽⁸⁶⁾ Y (t _1/2 = 14.7 시간), 또는 ⁽¹²⁴⁾ I (t _1/2 = 4.18 D). ⁽⁴⁾ 방사성 동위 원소 ^{표지왔다, 5} 단, 각이러한 방사성 동위 원소 임상 영상에 대한 적합성을 방해 상당한 한계를 가지고있다. ⁸⁶ Y ⁶⁴ 구리로 표지 radioimmunoconjugates 전임상 연구에서 유망한 입증하는 동안, 동위 원소는 인간의 이미지에 대한 효과가 너무 짧은 물리적 반감기를 가지고있다. ⁽¹²⁴⁾ 나는 반면에,에 대한 거의 이상적인 물리적 반감기 항체 촬상 있지만 고가이고 상대적으로 낮은 해상도 이미지를 임상 적으로 이어질 차선 감쇠 특성을 갖는다. 또한, ^I-124 표지 radioimmunoconjugates는 생체 내 종양 대 배경 활성 비율을 낮출 수를 탈 할로겐 처리의 대상이 될 수있다. ^-6,7-

이 드라이브는 ⁶⁴ 잘라 내기, ⁽⁸⁶⁾ Y를 대체 할 수있는 양전자 방출 방사성 동위 원소를 발견하고, radioimmunoconjugates ¹²⁴ 전 ⁸⁹ ZR 표지 항체에 대한 연구의 급등을 자극했다. ^8-12에게 T를⁸⁹ ZR의 출현에 대한 그 이유는 간단하다 : 방사성 진단 PET의 radioimmunoconjugates에 사용하기 위해 가까운 이상적인 화학적 및 물리적 특성을 가지고 ^{13 89} ZR은 ⁸⁹ Y (P, N)을 사용하여 사이클로트론에 ⁸⁹ ZR의 반응을 통해 생성된다. 시판되는 100 % 천연 풍부한 ⁸⁹ Y 타겟. ^14,15 방사성은, 23 %의 양전자 수율을 갖는다 78.4 시간의 반감기로 붕괴 및 395.5 keV의 (도 1)의 비교적 낮은 에너지로 양전자를 방출한다. 그것은 ^{89 13,16,17} ZR 또한 높은 에너지를 방출하는 것이 중요하고, 909 keV의 γ 선 99 % 효율. 방출이 방출 광자 511 keV의 에너지 적으로 방해하지 않는 반면, 전송, 처리, 선량에 대해서 고려를 필요 여분 않는다. 이 경고에도 불구하고, 이러한 부패의 특성은 궁극적으로 ⁸⁹ ZR이 더 유리한 시간을 가지고뿐만 아니라 의미구리 ⁸⁶ Y ⁶⁴ 이상 항체 이미징을위한 ALF 생활뿐만 아니라 더 높은 687, 975 케빈의 에너지뿐만 아니라의 100 ~ 150 keV의 내부 에너지와 광자의 번호와 양전자를 방출하는 ¹²⁴ I보다 높은 해상도의 이미지를 생성 할 수 있습니다 511 keV의 양전자 생성 된 광자. ⁽¹³⁾ 또한, ⁸⁹ ZR은 방사성 옥소 대응보다 더 효과적으로 또한 종양, 처리 할 안전 생산 저렴하고 residualizes이다. ^89의 Zr ^{(18, 19)} 하나의 잠재적 인 제한이없는 것입니다 isotopologue 치료, 예를 들면, Y ⁽⁸⁶⁾ (PET) ⁹⁰ 대 Y (치료). 이것은 그들의 대응 치료 용 선량 정찰병으로 사용할 수있는 화학적으로 동일 대리 조영제의 구성을 배제한다. 그것은 말했다 조사는 ⁸⁹ ZR 표지 항체는 ⁹⁰ Y- ¹⁷⁷ 루 표지 면역 접합체에 대한 이미징 대리로 잠재력을 가지고 수행하는 것이 좋습니다.^{(20, 21)}

화학적 인 관점에서, 그룹 IV 금속으로서, ⁸⁹ ZR은 수용액 중의 양이온 +4로서 존재한다. ZR ⁴⁺ 이온은 높은, 비교적 큰 (유효 이온 반경 = 0.84 Å) 충전되고, "하드"양이온로 분류 될 수있다. 이와 같이, 여덟 하드 음이온 산소 도너 리간드 담까지 선호를 나타낸다. 쉽게 ^ZR-89 radioimmunoconjugates 표지에 사용되는 가장 일반적인 킬레이트가 desferrioxamine이다 (DFO), 세 그룹 히드 담지 시데로 포어 유래 비 환식 킬레이트. 리간드 안정적 생물학적 관련성의 pH 레벨에서 RT로 신속하고 깨끗하게 ZR ^{4+ 양이온을} 조정하고, 생성 ZR-DFO 착체는 식염수, 혈청에서 여러 날에 걸쳐 안정적으로 유지하고, 전혈. ²² 전산 연구가 강하게 시사 DFO는 금속 중심에 배위 세 neut되는 ZR ⁴⁺ hexacoordinate 복합체를 형성하도록RAL과 리간드의 세 음이온 산소 기증자뿐만 아니라 두 개의 외생 물 리간드 (그림 2). ^{(23, 24) 89} ZR-DFO의 접합 발판을 사용 radioimmunoconjugates의 생체 내 행동은 일반적으로 우수한있다. 그러나 어떤 경우에는, 이미징 및 급성 생체 분포 연구는 ⁸⁹ ZR – 표지 된 항체를 주입 한 쥐의 뼈 높은 활동 수준, ZR ⁴⁺ 양이온은이어서 생체 내에서 킬레이트로부터 방출되고, ⁸⁹ osteophilic가 mineralizes 제안 데이터를 밝혀냈다 뼈. 여덟 산소 도너가 문헌에 나타난 ^{25 최근,} 신규 ZR ^{89 4+} 킬레이트 제의 개발에 대한 조사의 수는 특히, 현재, 그럼에도 ^24,26,27. DFO 리간드는 가장 널리 사용되는 킬 레이터 ⁸⁹ 넓은 여백에 의해 radioimmunoconjugates을 ZR은 표지. 다른 다양한바이오 콘쥬 게이션 전략 bioorthogonal 클릭 화학, 항체의 시스테인 구축 티올 반응 DFO의 반응, 에스테르 베어링 DFO는 항체에 라이신 구축 활성화의 반응을 포함하여, 항체 DFO를 연결하는 데 사용되어왔다. ^{4,28- 30 쉽게} 가장 일반적인 방법은, 그러나, ²² 견고이 시판 관능 킬레이트. DFO, DFO-NCS의 이소 티오 시아 네이트 – 함유 유도체의 사용을 (도 2)이었다 안정적의 리신으로 안정한 공유 결합 티오 우레아 결합을 형성했다 항체 (그림 3).

지난 몇 년 동안, ⁸⁹ ZR-DFO – 표지 radioimmunoconjugates 다양한는 문헌에보고되어있다. 전임상 연구는 CD105-대상으로 T로 세툭시 맙, 베바 시주 맙과 트라 스투 주맙 난해한 항체로 더 잘 알려진 이르기까지 항체를 특징으로, 특히 풍부한되었습니다RC105 및 5A10을 FPSA를가 타겟팅. ^30-36 최근 ⁸⁹ ZR-DFO 표지 된 항체를 사용하여 초기 단계의 임상 시험 소수 문헌에 등장했다. ⁸⁹ ZR-DFO-cmAb의 U36, ⁸⁹ ZR-DFO-ibritumomab의 tiuxetan, ⁸⁹ ZR-DFO – 트라 스투 주맙. ^21,32,37 또한, ^89와 다른 임상 시험의 범위를 사용 특히, 네덜란드 그룹이 발행 한 시험 ZR 표지 radioimmunoconjugates 전립선 암 이미징 PSMA 타겟팅 ⁸⁹ ZR-DFO-J591과 유방암 이미징 HER2-대상으로 ⁸⁹ ZR-DFO – 트라 스투 주맙을 사용하여 기념 슬로안 케터링 암 센터에서 여기에 조사를 포함하여, 현재 진행되고있다. ^23, 방사성 표지 된 항체는 가장 일반적인 ZR ⁽⁸⁹⁾ 표지 된 방사성 의약품을 유지하면서 또 ^30, 방사성도 점점 펩티드, 단백질, 및 나노 물질을 포함하는 다른 벡터들과 함께 사용되어왔다. ^38-43 </sup>

이 ⁸⁹ ZR-DFO 라벨링 방법의 모듈화는 엄청난 자산입니다. 바이오 마커 타겟팅 항체의 레퍼토리는 끊임없이 확장하고, 이러한 구조를 사용하여 생체 PET 영상에서 공연에 대한 관심은 빨리 성장하고있다. 결과적으로, 우리는 더 표준화 된 방법 및 프로토콜이 개발 분야 이익을 얻을 수 있다고 믿고있다. DFO-NCS의 활용 ⁸⁹ 지르코늄의 방사선 물질에 대한 우수한 기록 실험 프로토콜이 이미 Vosjan에 의해 출판 된, 등. ^{(22) 우리는이} 작품에서 제공하는 시각적 데모 더 이러한 기술에 새로운 연구자에게 도움이 될 수 있다고 생각합니다. 손 프로토콜, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체에 DFO – 이소 티오 시아 네이트 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션, ⁸⁹ (2) radiosynthesis 정제 ZR-DFO-단클론 항체 radioimmunoconjugate,및 (3)에서 암의 뮤린 모델에서 ^ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate 생체 내 PET 영상화. ^23,44,45

Protocol

설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다. J591에 DFO-NCS 1. 활용 1.7 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에서, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PH 7.4), 0.5 M HEPES 완충액 (pH 7.4) 중 어느 하나를 1ml의 J591 2-5 ㎎ / ㎖의 용액을 제조 하였다. 5 내지 10㎜ (3.8-7….

Representative Results

이 프로토콜 항체 DFO-NCS의 공액의 첫 번째 단계는 일반적으로 매우 견고하고 신뢰할 수있다. 일반적으로, 정제, 킬레이트 변성 면역 접합체는> 90 %의 수율로 얻을 수 있고, 초기의 접합 반응에서 DFO-NCS의 3 몰 당량을 사용하여 차수의 표지 약 1.0-1.5의 킬레이트 DFO의 수율 것이다 / 단클론 항체. 프로 시저의 89 ZR의 방사선 및 정제 단계는 마찬가지로 간단합니다. 위의 프로토콜에 설명 된 ?…

Discussion

건설, 방사성 표지, 및 이미징의 ^ZR-89-DFO labled radioimmunoconjugates이 다소 간단한 절차가 일반적이지만,이 프로세스의 각 단계에서 마음에 몇 가지 주요 고려 사항을 유지하는 것이 중요하다. 예를 들어, 아마도 절차 공액 단계 동안 우려 원인은 공액 반응 동안 항체의 집합이다. 이 문제는 대개 DFO-NCS 스톡 용액의 첨가 후 접합 반응의 불량한 혼합하는 제품이다.이 경우, DFO-NCS의 비균질 분포가…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide