El bioconjugación y Radiosíntesis de⁸⁹ Los anticuerpos marcados con Zr-DFO

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

La excepcional afinidad, especificidad y selectividad de los anticuerpos a tomar vectores extraordinariamente atractivos para radiofármacos PET-tumorales objetivo. Debido a su vida media biológica de varios días, los anticuerpos deben estar etiquetados con radionucleidos emisores de positrones con relativamente largos de decaimiento físico vidas medias. Tradicionalmente, los isótopos emisores de positrones ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 h), y ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 hr) se han utilizado para marcar anticuerpos para imágenes PET. Más recientemente, sin embargo, el campo ha sido testigo de un aumento dramático en el uso del metal radiactivo emisor de positrones ⁸⁹ Zr en agentes formadores de imágenes de PET basadas en anticuerpos. ⁸⁹ Zr es un radioisótopo casi ideal para la formación de imágenes PET con inmunoconjugados, ya que posee un medio físico -La vida (t _1/2 = 78,4 hr) que es compatible con la farmacocinética in vivo de anticuerpos y emite un relativamente bajo enopositrones rgy que produce imágenes de alta resolución. Además, los anticuerpos pueden ser francamente etiquetados con ⁸⁹ Zr usando el quelante de deferoxamina sideróforo derivada (DFO). En este protocolo, el antígeno de dirección de membrana J591 anticuerpo específico de la próstata se puede utilizar como un sistema modelo para ilustrar (1) la bioconjugación del quelante bifuncional DFO-isotiocianato a un anticuerpo, (2) la radiosíntesis y la purificación de un ⁸⁹ Zr radioinmunoconjugado DFO-mAb, y (3) en vivo de imágenes PET con un ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioinmunoconjugado en un modelo murino de cáncer.

Introduction

Debido a su notable sensibilidad, afinidad y selectividad, los anticuerpos han sido considerados vectores prometedores para el suministro de radioisótopos a las células cancerosas. Sin embargo, su aplicación en la tomografía por emisión de positrones (PET) se ha visto obstaculizada por la falta de un radioisótopo emisor de positrones adecuados para su etiquetado. ^1-3 Una de las consideraciones más importantes en el diseño de radioinmunoconjugados se coincida con el deterioro físico de media la vida del radioisótopo a la farmacocinética in vivo de los anticuerpos. Más específicamente, los anticuerpos a menudo tienen relativamente largos, de varios días biológicos vidas medias y por lo tanto deben ser etiquetados con radioisótopos con vidas medias físicas comparables. Para aplicaciones de imágenes de PET, los anticuerpos han sido tradicionalmente radiomarcado con ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 horas), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 horas), o ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d). ^{4, 5} Sin embargo, cada uno deestos radioisótopos posee importantes limitaciones que dificultan su idoneidad para la imagen clínica. Mientras radioinmunoconjugados marcadas con ⁸⁶ y ⁶⁴ Y Cu han demostrado ser prometedor en investigaciones preclínicas, ambos isótopos poseen vidas medias físicas que son demasiado cortos para ser eficaz para formación de imágenes en seres humanos. ¹²⁴ I, en cambio, tiene una vida media física casi ideal para formación de imágenes con anticuerpos, pero es caro y tiene características de desintegración subóptimas que conducen a la resolución relativamente baja imágenes clínicas. Además, ¹²⁴ radioinmunoconjugados I-marcado puede estar sujeto a deshalogenación in vivo, un proceso que puede reducir razones de actividad tumor a fondo. ^6,7

La unidad para encontrar un radioisótopo emisor de positrones para suplantar ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y, y ¹²⁴ I en radioinmunoconjugados ha alimentado el reciente aumento de la investigación en ⁸⁹ anticuerpos Zr-etiquetados. ^8-12 Tque la razón para el advenimiento de ⁸⁹ Zr es sencillo: el radiometal posee propiedades físicas y químicas casi ideal y para su uso en radioinmunoconjugados de PET de diagnóstico ^{13 89} Zr se produce a través de la ⁸⁹ Y (p, n) ⁸⁹ reacción Zr en un ciclotrón usando una. comercialmente disponible y 100% naturalmente abundante objetivo ⁸⁹ Y ^14,15. El metal radiactivo tiene un rendimiento de positrones de 23%, se desintegra con una vida media de 78,4 h, y emite positrones con la relativamente baja de energía de 395,5 keV (Figura 1). ^13,16,17 Es importante señalar que ⁸⁹ Zr también emite una alta energía, 909 keV γ-ray con 99% de eficiencia. Mientras que esta emisión no interfiera con energía con las emitidas 511 keV fotones, requiere consideración adicional en relación con el transporte, la manipulación y la dosimetría. A pesar de esta advertencia, estas características de desintegración en última instancia significa que ⁸⁹ Zr no sólo tiene una h más favorablealf-vida para formación de imágenes con anticuerpos que ⁸⁶ Y ⁶⁴ y Cu pero también puede producir imágenes de mayor resolución de ¹²⁴ I, que emite positrones con mayores energías de 687 y 975 keV, así como un número de fotones con energías dentro de 100-150 keV de los fotones de positrones creado 511 keV. ¹³ Por otra parte, ⁸⁹ Zr es también más seguro de manejar, menos caro de producir, y residualizes en los tumores más eficazmente que su homólogo de yodo radioactivo. ^18,19 Una limitación potencial de ⁸⁹ Zr es que no tiene un Isotopólogo terapéutico, por ejemplo, ⁸⁶ Y (PET) vs. ⁹⁰ Y (terapia). Esto impide la construcción de agentes de imagen químicamente idénticos, sustitutos que pueden emplearse como exploradores dosimétricos para sus contrapartes terapéuticas. Dicho esto, las investigaciones sugieren que los anticuerpos ⁸⁹ Zr-etiquetados tienen potencial como sustitutos de imágenes para ⁹⁰ Y- y ¹⁷⁷ inmunoconjugados marcados con Lu.^20,21

Desde un punto de vista químico, como un metal del Grupo IV, ⁸⁹ Zr existe como un catión 4 en solución acuosa. El ion Zr ⁴⁺ está altamente cargada, relativamente grande (radio iónico efectivo = 0,84 Å), y puede ser clasificado como un catión "duro". Como tal, exhibe una preferencia por ligandos que llevan hasta ocho donantes de oxígeno duros, aniónicos. Fácilmente el quelante más común usado en ⁸⁹ radioinmunoconjugados marcados con Zr es la deferoxamina (DFO), un sideróforo derivada, quelante acíclico teniendo tres grupos hidroxamato. El ligando coordina de forma estable el catión Zr ⁴⁺ rápida y limpia a temperatura ambiente a niveles de pH biológicamente relevantes, y el complejo de Zr-DFO resultante permanece estable durante el curso de varios días en solución salina, suero de la sangre, y la sangre entera. ²² estudios computacionales sugieren fuertemente DFO que forma un complejo con hexacoordinate Zr ⁴⁺ en la que el centro metálico se coordina a los tres neutral y tres donantes de oxígeno aniónicos del ligando, así como dos ligandos de agua exógenos (Figura 2). ^23,24 El comportamiento in vivo de radioinmunoconjugados que emplean la conjugación de andamio ⁸⁹ Zr-DFO ha sido en general excelente. Sin embargo, en algunos casos, las imágenes y los estudios de biodistribución agudas han revelado los niveles de actividad elevados en los huesos de los ratones inyectados con ⁸⁹ anticuerpos Zr-etiquetados, datos que sugiere que la osteophilic ⁸⁹ Zr ⁴⁺ catión se libera de la quelante in vivo y posteriormente mineraliza en el hueso. ²⁵ Recientemente, un número de investigaciones en el desarrollo de nuevos ⁸⁹ Zr ⁴⁺ quelantes particularmente ligandos con ocho donantes de oxígeno han aparecido en la literatura. ^24,26,27 Sin embargo, en la actualidad, el DFO es el quelante más ampliamente empleado en ⁸⁹ radioinmunoconjugados Zr-etiquetados por un amplio margen. Una variedad de diferentesestrategias bioconjugation se han empleado para unir DFO a anticuerpos, incluyendo la química clic bioorthogonal, la reacción del tiol reactiva DFO construye con cisteínas en el anticuerpo, y la reacción del éster activado de soporte de DFO construye con lisinas en el anticuerpo. ^{4,28- 30} Fácilmente la estrategia más común, sin embargo, ha sido el uso de un derivado de isotiocianato de soporte de DFO, DFO-NCS (Figura 2). ²² Este quelante bifuncional disponible comercialmente robusta y fiable forma, vínculos tiourea covalentes estables con las lisinas de la anticuerpo (Figura 3).

En los últimos años, una amplia variedad de ⁸⁹ radioinmunoconjugados marcados con Zr-DFO han sido reportados en la literatura. Investigaciones preclínicos han sido especialmente abundantes, con anticuerpos que van desde la más conocida el cetuximab, bevacizumab y trastuzumab a anticuerpos más esotéricos como el CD105 de metas de TRC105 y fPSA de metas 5A10. ^30-36 Más recientemente, un pequeño número de ensayos clínicos de fase temprana utilizando anticuerpos marcados ^89-Zr-DFO han surgido en la literatura. Ensayos Específicamente, los grupos en los Países Bajos han publicado que emplean ⁸⁹ Zr-DFO-CMAB U36, ⁸⁹ Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, y ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 Además, una serie de otros ensayos clínicos con ⁸⁹ radioinmunoconjugados marcados con Zr están actualmente en curso, incluidas las investigaciones aquí en el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering utilizando el PSMA de metas de ⁸⁹ Zr-DFO-J591 por imagen del cáncer de próstata y el ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab HER2-dirigido por imagen del cáncer de mama. ^{23, 30} Además, mientras que los anticuerpos radiomarcados siguen siendo los ⁸⁹ radiofármacos marcados con Zr más comunes, el metal radiactivo ha sido empleado también cada vez más con otros vectores, incluyendo péptidos, proteínas, y los nanomateriales. ^38-43 </sup>

La modularidad de este ⁸⁹ metodología etiquetado Zr-DFO es un enorme activo. El repertorio de anticuerpos de biomarcadores de metas es cada vez mayor, y el interés en la realización de la PET vivo utilizando estas construcciones está creciendo a buen ritmo. Como resultado, creemos que el desarrollo de las prácticas y protocolos más estandarizados podría beneficiar el campo. Una excelente protocolo experimental escrito para DFO-NCS conjugación y ⁸⁹ Zr radiomarcaje ya ha sido publicada por Vosjan, et al. ²² Creemos que la demostración visual proporcionada por este trabajo podría ayudar aún más a los investigadores nuevos a estas técnicas. En el protocolo a mano, el antígeno de dirección de membrana J591 anticuerpo específico de la próstata se puede utilizar como un sistema modelo para ilustrar (1) la bioconjugación del quelante bifuncional DFO-isotiocianato a un anticuerpo, (2) la radiosíntesis y la purificación de la ⁸⁹ radioinmunoconjugado Zr-DFO-MAB,y (3) in vivo de formación de imágenes PET con una Zr-DFO-mAb radioinmunoconjugado ⁸⁹ en un modelo murino de cáncer. ^23,44,45

Protocol

Todos los experimentos con animales en vivo descritos fueron realizados de acuerdo con un protocolo aprobado y con las normas éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. La conjugación de DFO-NCS a J591 En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una solución de 2-5 mg / ml de J591 en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (pH 7,4) o 0,5 M de tampón HEPES (pH 7,4). Di…

Representative Results

El primer paso en este protocolo la conjugación de DFO-NCS al anticuerpo es típicamente bastante robusto y fiable. Generalmente, la, inmunoconjugado modificado quelante-purificado puede obtenerse con un rendimiento> 90%, y el uso de 3 equivalentes molares de DFO-NCS en la reacción inicial Conjugación producirá un grado de etiquetado del quelante de aproximadamente 1,0-1,5 DFO / MAB. Los 89 Zr de radiomarcaje y purificación pasos del procedimiento son igualmente sencillo. A las concentraciones descrit…

Discussion

Si bien la construcción, radioinmunoconjugados labled-Zr-DFO radiomarcaje, y las imágenes de ⁸⁹ es generalmente un procedimiento bastante sencillo, es importante mantener algunas consideraciones clave en mente durante cada paso del proceso. Por ejemplo, tal vez la causa más probable de preocupación durante la etapa de conjugación del procedimiento es la agregación del anticuerpo durante la reacción de conjugación. Este problema es más a menudo un producto de mala mezcla de la reacción de conjugació…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide