여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.
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방법 논문
질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
벡터 모기는 다른 생물보다 더 인간의 고통을 입힐 - 이상 백만명 매년 죽인다. 모기 게놈 프로젝트는 기본 아프리카 말라리아 벡터과 아노 펠 레스 gambiae 및 뎅기열과 황열병 벡터 Aedes aegypti의 유전학적인 연구를 포함하여 모기 생물학의 새로운 측면에서 연구를 촉진. RNA 간섭 - (RNAi-) 매개 유전자 침묵은 이러한 질병 벡터 모기 종 모두에 대한 관심의 유전자를 대상으로 사용되어왔다. 여기서는 음식 합하고 유충 섭취 RNA 간섭 나노 입자 / 키토산의 제조 과정을 설명한다. 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA에) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA의) 분자와 호환이 기술적으로 간단 높은 처리량 및 비교적 저렴한 방법은, A. 다른 유전자의 숫자의 성공적인 최저 사용되어왔다 gambiae 및 A. aegyptiQRT-PCR을 통해 또는 현장 하이브리드에 확인 유충. 애벌레의 먹이에 따라, 최저는, 적어도 후반 번데기를 유지할 수 있습니다. 이 방법론은 모기 및 농업 해충 곤충을 포함하는 다른 종의 다양한뿐만 아니라 다른 비 유기체 모델에 적용될 수있다. 연구 실험실에서 유용성 외에도 향후, 키토산, 저렴하고, 비 독성 및 생분해 성 중합체, 잠재적 분야에서 이용 될 수있다.
서론
Anopheline과 Aedine 장군의 혈액 공급 벡터 모기는 인류 최악의 재앙의 몇 가지에 대한 책임 질병을 유발하는 에이전트를 전송합니다. 추정 34억명는 매년 전 세계에 걸쳐 절반 만 죽음에 대한 책임이 말라리아, 계약에 대한 위험이 있습니다. 말라리아 특검팀에 의해 감염 말라리아 결과. 주요 아프리카 벡터과 아노 펠 레스 gambiae (를 포함하여 얼룩 날개 속의 감염된 모기의 물린 상처를 통해 사람에게 전송되는 기생충, http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) 1. Aedes aegypti는 뎅기열, 세계에서 가장 광범위하고 중요한 arboviral 질병 비특이적 열성 질환을 일으키는 뎅기 바이러스에 대한 기본 모기 벡터이다. 뎅기열 바이러스는 매년 inciden으로, 현재 열대> 25억명에 대한 위협이다24,000 사망자 매년 ~의 결과로 약 5천만가지 경우의 CE ( http://www.cdc.gov/dengue/ 2014) 2. 인간의 건....
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프로토콜
1. 모기 종과 양육을
- A. 유지 gambiae의 G3와 A. aegypti 리버풀 IB12의 (아래의 대표 연구에 사용) 균주 또는 표준 실험실 연습에 또는 이전에 23, 24 설명한대로 따라 관심의 다른 균주.
2. dsRNA를하고 siRNA를 디자인 및 제작
- 디자인 프라이머는 관심의 유전자에 특정 긴 dsRNA를 템플릿을 구성합니다. E-RNAi의 도구 (25)를 사용합니다. 같은 또는 선택의 방법에 따른 dsRNA를 생산 이전에 설명 19.
- 음성 대조군의 경우, 녹색 형광 단백질 (GFP), β - 갈 락토시다 제 (β-GAL), 또는 모기로 표현하지 다른 유전자의 서열에 해당하는 dsRNA (19)를 합성. 목적한다면, 다음과 같이 요약 대표적인 결과를 생성하기 위해 이용 된 dsRNA (19)은 양성 대조군으로 사용할 수있다. 스토어 dsRNA를 -80 °에서 RNAse가없는 물에 용해 된; C가 필요할 때까지.
- 또한, 디자인 유전자 특이 적 siRNA를 표준 실험실 관행에 따라 또는 이전 ....
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결과
A. gambiae :
키토산 / 나노 dsRNA에 의한 키토산의 아미노기와의 dsRNA의 인산기 간의 정전 상호 작용으로 형성된다. 용액으로부터의 dsRNA의 고갈에 의해 측정하는 나노 입자에 혼입하는 dsRNA의 효율은 일반적으로 90 % 이상입니다. 원자력 현미경 이미지 표시하는지 100-200 nm의 (도 1)에 이르는 직경 키토산 dsRNA에 입도 140 nm의 평균.
키토산 및 RNA 간섭에 의해도 1의 나노 입자 형성. 키토산 / dsRNA를 나노 입자 (A) 또는 dsRNA를 <.......
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토론
본원에 기술 된 키토산 / RNA 간섭 나노 방법론 효과적으로 A.에서 유생 중에 유전자를 대상으로 사용되어왔다 gambiae (도 2, 3) 및 A. aegypti (도 4, 5, 6, 표 1, 2). 키토산 나노 입자는 본원에 기재된 대표적인 결과에 의해 입증되는 바와 같이 모기에서 성공적으로 사용되어왔다 둘 또는 긴 dsRNA에 siRNA를, 어느 제조 될 수있다. dsRNA에의 합성 siRNA를 구매보다 저렴하지만, 더 노동 집약적이다. 키토산 / siRNA를 사용하는 경우, 표현형 폭로 표현형 오프 사이트에 의한 타겟팅 아니라고 더 확신을 허용 다중 siRNA를 함께 확인할 수있다. 또한, siRNA를 한꺼번에의 상업 생산은 더 나은 분야에 종 특이 모기 제어 RNA 침묵을 방해 / 키토산의 확장을 용이하게 할 수있다. 이것은 물론 obsta 극복 필요이러한 비용 및 배달과 같은 사이클 사용.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Kansas Agricultural Experiment Station과 K-State Arthropod Genomics Center에서 KYZ에 대한 자금 지원으로 A. gambiae19에서 키토산/dsRNA 매개 유전자 침묵의 원래 개발을 지원했습니다. 여기에 설명된 A. gambiae 작업은 NIH/NIAID에서 KM으로의 R01-AI095842에 의해 부분적으로 지원되었습니다. A. aegypti20,21에서 키토산/siRNA 매개 유전자 침묵의 개발은 MDS에 대한 NIH/NIAID 상 R01-AI081795의 지원을 받았습니다. 이 연구의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | 간섭 RNA의 재현탁 |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | 방해 RNA의 재현탁 및 간섭 RNA/나노 입자 준비 |
| 0.5 ml 졸업 튜브 | Fischer Scientific | 05-408-120 | 재현탁 간섭 RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | 간섭 RNA의 재현탁 및 간섭 RNA/나노 입자 |
| 1.5 ml 졸업 튜브의 준비를 위해 | Fischer Scientific | 05-408-046 | 간섭 RNA/나노 입자 |
| 1M 아세트산 나트륨, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | 제조를 위한 |
| AIRSTAR. ACS, USP, FCC 등급 | BDH | VWR BDH3092-500MLP | 는 아세트산 나트륨 완충액을 준비합니다 |
| . | 800668 준비된 간섭 RNA/나노 입자 | ||
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | 를 펠렛 간섭 RNA/나노 입자 |
| 키토산으로, 새우 껍질에서 | Sigma-Aldrich | C3646-25G | 를 간섭 RNA/나노 입자의 준비를 위해 간섭 RNA와 결합 |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | 에서 간섭 RNA/나노 입자를 가진 모기 유충 먹이를 준비합니다. 나노 입자 |
| E-RNAi 도구 | dsRNA 설계를 위한 | 독일 암 연구 센터 | NA |
| 금붕어 먹이 | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | 간섭 RNA/나노 입자로 모기 유충 먹이를 준비하기 위한 |
| 수조 | Thermo Scientific | 51221048 | 간섭 RNA/나노 입자를 55oC에서 가열합니다 |
| 얼음 | 해당 없음 | 간섭 RNA 해동 및 간섭 RNA/나노 입자 | |
| [header] | |||
| 얼음 양동이 | Fisher Scientific | 02-591-44 | 절차 중 얼음 저장용 |
| 간 분말 | MP Biomedicals LLC. | 간섭 RNA/나노 입자 처리 후 모기 유충에게 먹이를 주는 | 900396 |
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| pH 측정기 | 버퍼용 Mettler Toledo | S220 | |
| 면도날 | Fischer Scientific | 12-640 | 공급용 간섭 RNA/나노 입자 펠릿 |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | 맞춤형 | siRNA/나노 입자 |
| 황산나트륨, 무수(Na2SO4) | BDH/VWR | VWR BDH0302-500G | 되어 간섭 RNA가 50mM 황산나트륨 용액을 준비하도록 분배됩니다. |
| 수조 온도를 측정하기 위한 | 현탁 온도계 | VWR | 61066-046 |
| 이빨 선택 | VWR | 470146-908 | 간섭 RNA/나노 입자 식품 준비 및 젤 펠릿 절단 중 교반 |
| 저 냉동고 | -80oC에서 간섭 RNA 분취액 및 간섭 RNA/나노 입자의 저장에 적용할 수 없는 다양한 공급업체 -80supo/supC에서 간섭 RNA 분취액 및 간섭 RNA/나노 입자의 저장 | 적용할 수 없는 | 공급업체 |
| 키토산/간섭 RNA 준비 용 | Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 |
| 중량 종이 | Fischer Scientific | NC9798735 | 공급을 위해 간섭 RNA / 나노 입자 펠릿을 분할합니다 |
참고문헌
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organizat....
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