تسليم<em> في فيفو</em> الحاد المتقطع نقص الأكسجة في الأطفال حديثي الولادة القوارض لرئيس Subventricular المنطقة المستمدة من الثقافات خلية العصبية السلف
Summary
توضح هذه المقالة منهجية لإدارة فترات قصيرة من نقص الأكسجين المتقطع للما بعد الولادة يوم 08/01 الماوس أو الفئران الجراء. هذا النهج يثير بشكل فعال على مستوى الأنسجة قوي "فتيلة تأثير" على الخلايا الاصلية العصبية مثقف التي يتم حصادها خلال 30 دقيقة من التعرض نقص الأكسجين.
Abstract
Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو تقديم بتكاثر وفعالية نوبات متقطعة من الأكسجين النظامية المحيطة خفضت إلى القوارض حديثي الولادة. الأساس المنطقي لاستخدام نقص الأكسجين المتقطع (IH) لمعالجة بيولوجيا الخلايا الجذعية تنبع من في المختبر تجارب زراعة الخلية التي يتم تبديل O 2 محتوى وسائط النمو. على وجه التحديد، بالمقارنة مع الظروف "القياسية" من 20٪ O 2، ثقافة ممتدة من الجذعية / السلف السكان الخلية الخلايا في 3٪ O 2 النتائج في زيادة انتشار، وانخفاض الخلايا وزيادة الخلايا العصبية 1،2 الغلة.
هذه المجموعة لديها خبرة كبيرة مع إدارة IH النظامية، وأجرت دراسات مستفيضة حول دور IH في اللدونة الجهاز التنفسي 3-7. هذا العمل، وهذا الاكتشاف الأخير الذي IH المزمن زيادة تكوين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي القوارض 10/08، يشكل الأساس لاستكشاف الحادة في الجسم الحينقص الأكسجة كحافز شروط مسبقة (أي قبل الحصاد الأنسجة) على ثقافة اللاحقة من الخلايا الجذعية / السلف العصبية (الشخصيات) 11. بشكل ملحوظ، عندما تعرضت الجراء الماوس إلى وجيزة (<1 ساعة) فترة من نقص الأكسجين الحاد المتقطع (AIH)، والخلايا التي تم حصادها من منطقة subventricular (SVZ) قد ارتفع بدرجة كبيرة القدرة على التوسع كما neurospheres أو خلايا أحادي الطبقة ملتصقة. ارتبط بروتوكول AIH أيضا مع التعبير زيادة من "مصير الخلايا العصبية" عامل النسخ (Pax6).
وفقا لذلك، في الجسم الحي قد توفر بروتوكولات AIH وسيلة ل"رئيس الوزراء" الشخصيات قبل الثقافة. على سبيل المثال، يمكن لتطبيقات هذا النهج تشمل توسيع السكان الخلية قبل الزرع في النظام العصبي المركزي المصاب، أو مجرد زيادة تمايز الخلايا العصبية من الخلايا المستنبتة قبل التجارب في المختبر. وعلاوة على ذلك، لأن هذا هو تسليم النظامية، أيالجهاز، الأنسجة أو الخلايا مرشحة لدراسة مماثلة. ولذلك، فإن البروتوكول كما هو مكتوب ينطبق المحتمل لمجموعة واسعة من الدراسات حول التلاعب الأكسجين المتقطع في الثدييات الصغيرة.
هناك بعض المزايا لهذا النهج. في الأعمال المنشورة آخرين، تم علاج حديثي الولادة كما القمامة مع السد في غرف منخفض الضغط، والذي يسمح لجرعات المزمنة، وأقل معالجة قبل العلاج، وعلى اتصال الأمهات أثناء العلاج 9. النهج الحالي يتجاوز العلاجات المتكررة إلى الأنثى تربية، أو استخدام سد مختلفة لكل تجربة. هذا البروتوكول يسمح أيضا دراسة حديثي الولادة المطابقة القمامة والعمر المتطابقة دقيقة. وتظهر بيانات تمثيلية قوة رئيسية أخرى من هذا البروتوكول، وهي السرعة التي AIH، وتسليمها، ويتسبب استجابة بيولوجية قوية ومتناسقة في البيولوجيا العصبية للخلايا الجذعية. هذا يضع سابقة لهذا البروتوكول للحصول بيولوجيا نسيجيا وعلى المستوى الخلويتغييرات كال أن يغير بيولوجيا الخلية.
سيعرض هذا التقرير الإجراءات التفصيلية استخدامها لتعريض الجراء القوارض إلى AIH فضلا عن التحليل السكاني الخلايا SVZ كما نمت neurospheres.
Protocol
Representative Results
Discussion
This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P., et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
