Consegna di<em> In Vivo</em> Acuta intermittente ipossia in Neonatale Roditore al Primo subventricolare Zone-derivati colture cellulari progenitrici neurali
Summary
Questo articolo descrive la metodologia per la somministrazione di brevi periodi di ipossia intermittente per postnatali giorno 1-8 di topo o ratto cuccioli. Questo approccio suscita effettivamente un livello del tessuto robusto "effetto priming" su colture di cellule progenitrici neurali che vengono raccolte entro 30 minuti dall'esposizione ipossia.
Abstract
Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire riproducibile ed efficace periodi intermittenti di sistemica di ossigeno ambiente abbassata a roditori neonatali. Il razionale per l'utilizzo di ipossia intermittente (IH) per manipolare biologia delle cellule staminali in vitro proviene da esperimenti di coltura cellulare in cui tenore di O 2 i mezzi di crescita è alterata. In particolare, rispetto alle condizioni "standard" del 20% O 2, cultura estesa staminali / progenitrici delle cellule popolazioni cellulari in 3% O 2 risultati in un aumento della proliferazione, diminuita apoptosi neuronale e una maggiore resa 1,2.
Questo gruppo ha una significativa esperienza con la somministrazione di IH sistemica, e ha condotto studi approfonditi sul ruolo della IH nella plasticità respiratoria 3-7. Questo lavoro, e la recente scoperta che IH cronica aumentata neurogenesi nei roditori CNS 8-10, costituisce la base per l'esplorazione di acuta in vivoipossia come stimolo precondizionamento (es., prima del raccolto tessuti) sulla successiva coltura di cellule neurali staminali / progenitrici (NPC) 11. Sorprendentemente, quando cuccioli di topo sono stati esposti a un breve periodo di acuta ipossia intermittente (IAC) (<1 ora), cellule che sono state raccolte dalla zona subventricolare (SVZ) era significativo aumento di capacità di espansione come neurosfere o cellule monostrato aderenti. Il protocollo AIH è stato anche associato con una maggiore espressione di un "destino neuronale" fattore di trascrizione (Pax6).
Di conseguenza, in vivo protocolli AIH possono fornire un mezzo di "prime" NPC prima cultura. Ad esempio, applicazioni di questo approccio possono includere espansione popolazioni di cellule prima del trapianto nel sistema nervoso centrale feriti, o semplicemente aumentando la differenziazione neuronale di cellule coltivate prima esperimenti in vitro. Inoltre, perché questa è una consegna sistemica, qualsiasiorgano, tessuto o cellula è un candidato per studio simile. Pertanto, il protocollo come scritto è potenzialmente applicabile ad una vasta gamma di studi sulla manipolazione ossigeno intermittente in piccoli mammiferi.
Ci sono alcuni vantaggi di questo approccio. In un altro lavoro pubblicato, i neonati sono stati trattati come una cucciolata con la diga in camere ipobariche, che consente la somministrazione cronica, meno manipolazione prima del trattamento, e mantenuto il contatto materno durante il trattamento 9. L'attuale approccio bypassa trattamenti ripetuti ad una femmina di allevamento, o l'uso di una diga differente per ciascun esperimento. Questo protocollo permette anche lo studio di precisi neonati lettiere corrispondenza e di pari età. Dati rappresentativi dimostrano un altro punto di forza di questo protocollo, vale a dire la rapidità con cui epatite autoimmune, come consegnato, provoca una risposta biologica potente e costante in biologia delle cellule staminali neurali. Questo stabilisce un precedente per questo protocollo di suscitare biologi tessutale e-livello cellularemodifiche CAL che alterano biologia cellulare.
La relazione illustrerà le procedure dettagliate utilizzate per esporre cuccioli roditori per EAI, nonché l'analisi della popolazione di cellule SVZ cresciuto come neurosfere.
Protocol
Representative Results
Discussion
This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
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