Выделение первичных клеток человека Колон опухоль из хирургических тканей и культивирование их прямо на мягкий эластичный субстратов для тяговых цитометрии
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
Раковые клетки реагируют на механическую жесткость матрицы сложным образом с помощью скоординированный иерархическую механо-химическую систему, состоящую из рецепторов адгезии и связанные сигнальной трансдукции мембранных белков, архитектуру цитоскелета и молекулярные двигатели 1, 2. Механоре- различных раковых клеток в пробирке исследовали в первую очередь с иммортализованных клеточных линий или мышиных получены первичные клетки, а не с первичными раковых клеток человека. Следовательно, очень мало известно о механоре- первичных человеческих клеток рака толстой кишки в пробирке. Здесь оптимизирован протокол разработан, что описано выделение первичных человеческих клеток толстой кишки у здоровых и раковых хирургических образцов тканей человека. Изолированные толстой кишки клетки затем культивируют успешно на мягкие (2 кПа жесткость) и жесткой (10 кПа жесткость) полиакриламидные гидрогели и жесткого полистирола (~ 3.6 ГПа жесткость) субстратов функционализованных внеклеточного матрикса (фибронектинв этом случае). Флуоресцентные микросферы, внедренные в мягких гелей вблизи поверхности клеточной культуры, и тяги анализ выполняется для оценки клеточных напряжений сократительные помощью бесплатного программного обеспечения с открытым доступом. Кроме того, иммунофлюоресценции микроскопии на различных подложках жесткости обеспечивает полезную информацию о первичной клеточной морфологии, цитоскелета и винкулина содержащей фокальные адгезии как функцию жесткости подложки.
Introduction
В последние годы она становится все более очевидным, что механическое микро-среды, в дополнение к био-химических факторов, играет важную роль в регуляции клеточных функций. Клетки могут воспринимать и реагировать на жесткости подложки, на которой они придерживались (как в 2D культуры) или в окружении (например, в 3D культуры) 3-7. Поступая таким образом, клетки могут модулировать их дифференциацию 3, 4, морфологию миграции / моторику 5, био-физических свойств 6, 7, рост и другие процессы.
Раковые клетки также реагируют на матрицы жесткости 2D и 3D, используя скоординированный, иерархическую механо-химическую комбинацию рецепторов адгезии и трансдукции сигнала, связанные мембранные белки, архитектуру цитоскелета и молекулярные моторы 1, 2. Например, эпителиальных клеток молочной железы (МИК) образуют нормальную паренхиму ацинарных при культивировании на 150 Па субстратов, что похожа на жесткостьздорового ткани молочной железы. Интересно, что они проявляют признаки развивающейся опухоли, как структурные, так и транскрипционные, при культивировании на жестких подложек (> 5000 Па), которые имитируют жесткость опухоли стромы 8. Кроме того, еще один эксперимент показывает, что рак молочной канцерогенез сопровождается коллагена сшивание и ЕСМ жесткости 9. Недавние эксперименты показывают, что карциномы толстой кишки человека (НСТ-8) клетки обладают метастазы, как фенотип (MLP), когда они культивируют на 2D подложек, имеющих физиологически соответствующую жесткость (20-47 кПа), но не на очень жесткой (3,6 ГПа) субстраты 10- 12 которые пребывают клетки первой форме опухолевидные кластеры клеток и затем отделить друг от друга, начиная от периферии. Как этого эпителия к округлой морфологического (Е к R перехода) происходит изменение, они размножаются, уменьшить клетка-клетка и клетка-ECM адгезию, и стать миграционная. НСТ-8 клетки культивировали на очень жестких полистирольных подложках не обладают этимизлокачественные черты. Таким образом, была выдвинута гипотеза, что НСТ-8 метастатической клетки становятся из-за их воздействия соответствующей микросреде. Стоит отметить, что эти эксперименты проводились с иммортализованных клеточных линий рака или мышиных получены первичные клетки, а не с первичными раковых клеток человека.
Недавнее исследование предполагает, что дополненной сотовой тяги стресс может быть использован в качестве потенциального биофизической подписи для метастатических клеток 13 .The исследование включает измерение силы тяги для различных линий раковых клеток человека на полиакриламидном геле. Установлено, что метастатические раковые клетки могут оказывать значительно большее тяговое усилие по сравнению с не-метастатических клеток во всех случаях 13. Тем не менее, эти результаты прямо противоречат ранее опубликованные выводы о мышиных получены линии клеток рака молочной железы 14. Кроме того, недавнее исследование подчеркивает замечательные различия между иммортализованных и первичных клеток человека в их цитоскелета реконструкции проTein профилирование и экспрессии белка выживания клеток 15. Следовательно, важно, чтобы повторно многие из биофизических анализов, включая тяги для первичных раковых клеток человека. Это будет решать вопрос первичные клетки воспроизводят ли увековечен клеточных линий рака тяги тенденцию.
Протокол, описанный здесь, оптимизирована для выделения первичных человеческих клеток толстой кишки (как здоровых, так и раковых), и для их культивирования на мягких подложках (полиакриламидных гидрогелей), а также на чашках Петри. Протокол основан на пищеварение и, как следствие ферментативной диссоциации хирургического образца ткани в одной клеточной суспензии 16. По нашим сведениям, это первая демонстрация культивирования изолированных первичной опухоли толстой кишки и нормальные клетки непосредственно на мягких гидрогелевых субстратов со встроенными люминесцентными микросфер для тяги цитометрии. Прозрачные гелевые подложки также позволяют иммуноокрашивания. Этот анализ показал, различия в F-актин организации ифокальные адгезии в первичных человеческих клеток толстой кишки, как изменения субстрат жесткости. Эта ячейка культуры платформа открывает возможность изучения различных биофизических свойств первичных человеческих клеток, таких как жесткость клеток и тяги в качестве параметров для прогнозирования рака.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сотовый тяги стресс в последнее время появились в качестве потенциального биофизической показателя метастатической стадии 13. Однако никаких экспериментальных данных, тяги с первичных опухолевых клеток не существует в литературе до сих пор. Кроме того, непосредственно культиви…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
