عزل خلايا ورم القولون الإنسان الأساسية من الأنسجة الجراحية وزراعة بشكل مباشر على لينة مرنة ركائز للالجر الخلوي
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
الخلايا السرطانية تستجيب إلى matrix صلابة ميكانيكية بطريقة معقدة باستخدام، نظام هرمي للتنسيق والميكانيكية والكيميائية تتألف من مستقبلات الالتصاق والبروتينات المرتبطة الغشاء نقل الإشارة، والهندسة المعمارية هيكل الخلية، والمحركات الجزيئية 1 و 2. Mechanosensitivity الخلايا السرطانية المختلفة في المختبر ل التحقيق في المقام الأول مع خطوط الخلايا خلد أو الفئران المستمدة الخلايا الأولية، وليس مع خلايا سرطانية بشرية الأولية. وبالتالي، لا يعرف إلا القليل عن mechanosensitivity من خلايا سرطان القولون الإنسان الأساسية في المختبر. هنا، تم تطوير بروتوكول الأمثل الذي يصف عزل الخلايا القولون الإنسان الأساسية من العمليات الجراحية عينات الأنسجة البشرية السليمة والسرطانية. خلايا القولون معزولة ثم يتم تربيتها بنجاح في الناعمة (2 كيلو باسكال صلابة) وقاسية (10 كيلو باسكال صلابة) الهلاميات المائية بولي أكريلاميد والبوليسترين جامدة (~ 3.6 جيغا صلابة) ركائز functionalized من قبل المصفوفة خارج الخلية (فبرونيكتينفي هذه الحالة). هي جزء لا يتجزأ بلي الفلورسنت في المواد الهلامية اللينة قرب السطح ثقافة الخلية، ويتم تنفيذ الجر فحص لتقييم الضغوط مقلص الخلوية باستخدام البرمجيات الحرة ومفتوحة. بالإضافة إلى ذلك، المناعي المجهري على ركائز صلابة مختلفة ويوفر معلومات مفيدة عن التشكل الأساسي الخلية، وتنظيم الهيكل الخلوي وvinculin تحتوي على الالتصاقات البؤرية بوصفها وظيفة من الركيزة صلابة.
Introduction
في السنوات الأخيرة أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الميكانيكية البيئة الصغيرة، بالإضافة إلى العوامل البيولوجية والكيميائية، ويلعب دورا هاما في تنظيم وظائف الخلية. الخلايا يمكن الشعور والاستجابة للصلابة الركيزة التي تقوم على الالتزام لهم (كما هو الحال في الثقافة 2D) أو تحيط بها (كما في الثقافة 3D) 3-7. بذلك، يمكن خلايا تعدل التمايز بها 3، 4 التشكل، والهجرة / حركية 5، البيولوجية الخصائص الفيزيائية 6، 7 النمو، وغيرها من العمليات.
تستجيب الخلايا السرطانية أيضا إلى 2D و 3D مصفوفة الصلابة باستخدام منسقة الهرمي الجمع والميكانيكية والكيميائية للمستقبلات الالتصاق والبروتينات المرتبطة الغشاء نقل الإشارة، والهندسة المعمارية هيكل الخلية، والمحركات الجزيئية 1، 2. على سبيل المثال، الخلايا الظهارية الثديية (MECs) النموذج العادي حمة عنيبية عندما مثقف على 150 ركائز با مشابه لصلابةنسيج الثدي صحية. ومن المثير للاهتمام، ويحمل بصمات ورم النامية، على حد سواء الهيكلية والنسخي، عندما مثقف على ركائز أكثر صرامة (> 5000 باسكال) التي تحاكي صلابة من سدى الورم 8. بالإضافة إلى ذلك، تظهر تجربة أخرى أن تكون الأورام الثدي يترافق يشابك الكولاجين وECM تشنج 9. وتبين التجارب الحديثة أن سرطان القولون البشري (HCT-8) خلايا عرض ورم خبيث مثل النمط الظاهري (MLP) عندما تكون مثقف على ركائز 2D وجود تصلب ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (20-47 كيلو باسكال)، ولكن ليس على قاسية جدا (3.6 جيد جدا) ركائز 10- 12. هذه الخلايا شكل أول مجموعات الخلايا تشبه الورم ومن ثم تنأى عن بعضها البعض، بدءا من المحيط. لأن هذا الظهارية لتقريب الصرفي (E إلى R الانتقالية) يحدث تغير، فإنها تتكاثر، والحد من خلية خلية وخلية ECM التصاق، وتصبح المهاجرة. HCT-8 الخلايا المستزرعة على ركائز البوليسترين صعبة للغاية لا تظهر هذهالصفات الخبيثة. وبالتالي فقد تم الافتراض أن HCT-8 تصبح الخلايا المتنقل وذلك بسبب تعرضها لمناسبة البيئة الصغيرة. ومن الجدير بالذكر أن هذه التجارب التي أجريت مع خطوط الخلايا السرطانية مخلد أو الفئران المستمدة الخلايا الأولية، وليس مع خلايا سرطانية بشرية الأولية.
تقترح دراسة حديثة أن المعزز الإجهاد الجر الخلوية يمكن أن تستخدم كتوقيع الفيزيائية الحيوية المحتملة للخلايا النقيلي 13. ودراسة ينطوي على قياس قوة الجر لمختلف خطوط الخلايا السرطانية البشرية على المواد الهلامية بولي أكريلاميد. تبين أن الخلايا السرطانية المنتشر يمكن أن تمارس أعلى بكثير الإجهاد الجر مقارنة مع الخلايا غير المنتشر في جميع الحالات (13). ومع ذلك، فإن هذه النتائج تتناقض بشكل مباشر على نتائج الدراسة التي نشرت في وقت سابق على الفئران المستمدة خطوط خلايا سرطان الثدي 14. أيضا، تبرز الدراسة الأخيرة وجود فروق ملحوظة بين الخلايا البشرية مخلد والابتدائية في هيكل الخلية على إعادة المواليةالتنميط البروتين وبقاء الخلية البروتين التعبير (15). وبالتالي، فإنه من المهم إعادة النظر في العديد من فحوصات الفيزيائية الحيوية بما في ذلك الجر للخلايا السرطانية البشرية الأولية. وسوف يعالج مسألة ما إذا كانت الخلايا الأولية ألخص خلد خطوط الخلايا السرطانية الجر الاتجاه.
تم تحسين البروتوكول الموصوفة هنا لعزل الخلايا الأولية البشرية القولون (على حد سواء صحية والسرطانية)، وللزراعة منها على ركائز الناعمة (الهلاميات المائية بولي أكريلاميد)، وكذلك في أطباق بتري. ويستند هذا البروتوكول على الهضم ويترتب على ذلك تفارق الأنزيمية من عينة الأنسجة جراحية في تعليق وحيد الخلية 16. على حد علمنا، وهذا هو أول مظاهرة من زراعة معزولة ورم القولون الابتدائي والخلايا الطبيعية مباشرة على ركائز هيدروجيل لينة مع بلي الفلورسنت المدمجة للالجر الخلوي. ركائز هلام شفاف يسمح أيضا المناعية. وكشف هذا الاختبار الاختلافات في المؤسسة F-أكتين والالتصاقات البؤرية في خلايا القولون البشري الأولية باعتبارها الركيزة التغييرات صلابة. هذه المنصة زراعة الخلايا يفتح إمكانية استكشاف مختلف الخصائص الفيزيائية الحيوية من خلايا الإنسان الأولية مثل تصلب الخلايا والجر كمعلمات لprognostics السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ظهرت الإجهاد الجر الخلوية مؤخرا كمؤشر الفيزيائية الحيوية المحتمل للدولة النقيلي 13. ومع ذلك، لا توجد بيانات الجر تجريبية مع خلايا الورم الرئيسي موجود في الأدب حتى الآن. أيضا، لا يتم الإبلاغ عن زراعة خلايا القولون مباشرة الأساسي معزولة على مختلف المواد الهل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
