Isolering av primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske vev og dyrking dem direkte på myke, elastiske Underlag for Traction Cytometry
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
Kreftceller svare til matrise mekanisk stivhet på en kompleks måte ved hjelp av en koordinert, hierarkisk mekanisk-kjemisk system bestående av adhesjonsreseptorer og assosierte proteiner signaltransduksjon membran, den cytoskeletal arkitektur, og molekylære motorer 1, 2. Mechanosensitivity av forskjellige kreftceller in vitro er undersøkt primært med udødeliggjorte cellelinjer eller murine stammer primærceller, ikke med primære humane kreftceller. Derfor lite er kjent om mechanosensitivity av primære humane tykktarmskreftceller in vitro. Her blir en optimal protokoll som er utviklet som beskriver isolering av primære humane tykktarmceller fra friske kirurgiske og cancerøse humane vevsprøver. Isolerte kolon celler blir deretter dyrket med hell på myke (2 kPa stivhet) og stiv (10 kPa stivhet) polyakrylamid hydrogel og stiv polystyren (~ 3,6 GPa stivhet) substrater funksjon av en ekstracellulær matriks (fibronectini dette tilfellet). Fluorescent microbeads er innebygd i myke gels nær cellekultur overflaten, og trekkraft analysen er utført for å vurdere cellulære kontraktile påkjenninger ved hjelp av gratis open access programvare. I tillegg immunfluorescens mikroskopi på forskjellige stivhets underlag gir nyttig informasjon om primær cellemorfologi, cytoskeleton organisasjon og vinculin inneholder fokale sammenvoksninger som en funksjon av underlaget stivhet.
Introduction
I de senere årene har det blitt stadig tydeligere at mekanisk mikro-miljø, i tillegg til bio-kjemiske faktorer, spiller en viktig rolle i å regulere celle funksjonalitet. Celler kan sanse og svare på underlaget stivhet som de er overholdt (som i 2D kultur) eller omgitt av (som i 3D kultur) 3-7. Ved å gjøre dette, kan cellene modulere deres differensiering 3, morfologi 4, migrasjon / motilitet 5, bio-fysiske egenskaper 6, vekst 7, og andre prosesser.
Kreftceller også svare på 2D og 3D matrix stivhet ved hjelp av en koordinert, hierarkisk mekanisk-kjemisk kombinasjon av adhesjonsreseptorer og assosierte proteiner signaltransduksjon membran, den cytoskeletal arkitektur, og molekylære motorer 1, 2. For eksempel melke epitelceller (MECS) danne normal acinar parenkym når de ble dyrket på 150 Pa substrater som er lik stivhetenav sunn brystvev. Interessant, de viser kjennetegnene til et utviklings svulst, både strukturelle og transkripsjons, når dyrket på stivere underlag (> 5000 Pa) som etterligner stivhet av en svulst stroma 8. I tillegg viser en annen eksperiment som bryst tumorigenesis er ledsaget av kollagen kryssbinding og ECM stivne 9. Nyere forsøk viser at human colon carcinoma (HCT-8) celler viser metastaser som fenotypen (MLP) når de dyrkes på 2D-substrater med fysiologisk relevant stivhet (20-47 kPa), men ikke på meget stiv (3,6 GPa) substrater 10- 12 .Disse celler første form tumor-liknende cellegrupper og deretter ta avstand fra hverandre, fra periferien. Ettersom dette epitelial til avrundet morfologisk (E til R overgang) endringen skjer, de sprer, redusere celle-celle og celle-ECM heft, og bli vandrende. HCT-8 celler dyrket på svært harde polystyren underlag ikke utviser dissemaligne egenskaper. Det har således blitt antatt at HCT-8 celler blir metastatisk på grunn av deres eksponering for passende mikromiljø. Det er verdt å merke seg at disse forsøkene er utført med immortaliserte kreftcellelinjer eller murine avledet primærceller, ikke med primære humane kreftceller.
En nylig studie foreslår at augmented cellulært trekkraft stress kan brukes som en potensiell biofysisk signatur for metastatiske celler 13 sikret studien omfatter måling av trekkraften for forskjellige humane kreftcellelinjer på polyakrylamidgeler. Det er funnet at metastatiske kreftceller kan utøve betydelig høyere trekkraft belastning sammenlignet med ikke-metastatiske celler i alle tilfeller 13. Men disse resultatene direkte motsier tidligere publiserte funn på muse avledet brystkreft cellelinjer 14. Dessuten fremhever en fersk undersøkelse bemerkelsesverdige forskjeller mellom immortaliserte og primære humane celler i deres cytoskeletal ombygging protein profilering og celleoverlevelse protein uttrykk 15. Derfor er det viktig å se mange av de biofysiske tester, inkludert trekkraft for primære humane kreftceller. Dette vil ta opp spørsmålet om de primære celler rekapitulere immortalisert kreftcellelinjer trekkraft trend.
Protokollen er beskrevet her er optimalisert for isolering av primære humane tykktarmceller (både friske og kreft), og for dyrking av dem på myke underlag (polyakrylamid hydrogeler) samt på Petri-skåler. Protokollen er basert på spaltning og påfølgende enzymatisk dissosiasjon av kirurgisk vevsprøve til en enkelt cellesuspensjon 16. Så vidt vi vet er dette den første demonstrasjonen av dyrking isolert primær kolon svulsten og normale celler direkte på myke hydrogel substrater med innebygd lysrør microbeads for trekkraft Cytometry. Gjennomsiktige gel underlag også tillate farging. Denne analysen avslørte forskjeller i F-aktin organisasjon ogfokale sammenvoksninger i primære humane kolon celler som substrat stivhet endringer. Denne cellekultur plattformen åpner opp muligheten for å utforske ulike biofysiske egenskapene primære humane celler som celle stivhet og trekkraft som parametere for kreft prognostics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellular trekkraft stress har nylig dukket opp som en potensiell biofysisk indikator på metastatisk staten 13. Imidlertid finnes det ingen eksperimentelle grep data med primærtumorceller i litteraturen hittil. Dessuten er direkte dyrking av isolerte primærtykktarmceller på forskjellige stivhet polyakrylamidgeler ennå ikke rapportert. Derfor etablerer vi en optimalisert primære kolon cellekulturforhold på geleer og polystyren (figur 2). Fluorescent microbeads innkapsling nær cellekultu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
