İnsan Dupuytren en<em> Ex vivo</em> Miyofibroblastların Çalışması ve Ekstrasellüler Matriks Etkileşimleri Kültür
Summary
Dupuytren hastalığı (GG) avucunun bir fibroproliferatif hastalıktır. Burada, biz üç-boyutlu (3D) kültür sistemi DD kültür rezeksiyon örneklerinde bir protokol mevcut. Bu tür kısa vadeli kültür sistemi 3D yapı korunması ve fibrotik doku moleküler özelliklerini tanır.
Abstract
Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.
Introduction
Dupuytren hastalığı (DD), benign fibroproliferatif hastalık nedeniyle avucunun içinde nodüller ve kord oluşumuna parmakların fleksiyonu kalıcı olur. Hastalık yayılmış Kuzey Avrupa Kafkasyalılar arasında özellikle yüksek olmasına rağmen, hastalığın altta yatan genetik nedenleri 1 bilinmemektedir. DD temel özelliği, tendon ve el ve parmakların avuç derisi arasındaki boşluğu işgal zor bir fibröz doku oluşturan hücre dışı matriks (ECM) proteinleri (örneğin, kolajen), aşırı üretim sürekli ince hareketleri kesintiye el 2, 3. Hastalığın nüks fibrozis 1, 4 nedeni olarak altta yatan genetik değişiklikler göstermektedir. Etkili bir tedavi doğrudan hücresel ve moleküler düzeyde kontrol edilemeyen fibrotik mekanizmaları hedef olabilir.
Fibrozis Bizim son çalışma gelişmesine bizi açmıştıruyuşturucu testi potansiyeli ile insan fibrotik doku kısa vadeli kültürünü tanır yeni 3D kültür sistemi. Bu sistem 2B fibroblast kültürleri sınırlayıcı yaklaşımı aşmak ve fibrozis 5 aracılık TGFβ yolu aktivasyonu ekson atlama elde kısmi aşağı düzenlenmesi için bir rol, tanımlamak için yardımcı olmuştur.
Biz DD hastaların ex vivo insan rezeksiyon örnekleri miyofibroblastlar arasındaki etkileşimi ve çevresindeki ECM 5, 6 çalışma kültürüne bir yöntem geliştirdik. DD bağ dokusu fibrozis çalışma yanı sıra diğer fibrotik hastalıklar, cerrahi eksize histopatolojik analizi dayanır Numuneler, doku ve primer kültürlerinde ya da hücre sıralama prosedürlerin kuruluşundan fibroblastların izolasyonu. Onlar deneyci tarafından hastalık özelliklerine veya terapötik müdahale eksojen manipülasyon izin vermez çünkü bu yaklaşımlar oldukça statik bulunmaktadır. Ek olarak, birincil cell kültürleri kültür koşullarına uyum ve gen ifadesi özellikleri hatta erken geçişleri sırasında, her pasajda üzerine esasen in vivo durumdan farklı eğilimi (geçit 3 arasında ve 6) 7, 8. Biz atık cerrahi malzeme korumak başarmış hastaya özgü özellikleri ve bunların anti-fibrotik veya iltihap-önleyici ilaç bileşimlerinin tarama izin veren bir zaman süresi için ex vivo kültür koşulları.
Sistem DD fibroblastlar gibi diğer hücre tipleri 9 kültürlenmesi, önceden görüldüğü gibi, bağlantı üzerine doku değişimini önlemek, böylece, orta değil plastik doku teması sağlayan bir nitroselüloz zar üzerine dayanır. DD dokulardaki bu proteinlerin, büyük miktarlarda üretim için herhangi kolajen jel veya başka bir ECM protein alt-tabakası, gereklidir. Bu yerli ECM mikroçevresinin ve ciro günah bakımı için avantajlıdırce matriks substrat doku yapısının ve fonksiyonunun 10, 11 arasında önemli bir regülatör bulunmaktadır. Örneğin, bu gibi fibronektin, laminin ve kolajen gibi ECM proteinlerinin yanı Benzer epitel hücreleri 12 apikal-bazal polaritesi için gösterilen fibroblast ön-arka polarite, 13 etkileyebilir . Polarize hücreler, hücre göçü ve gen ekspresyonu, örneğin, zar üzerinde α1β1 integrini erişilebilirlik bir 14 kolajen tip hücre yapışmasını etkilediği tespit dışı moleküllerin asimetrik dağılımına sahiptir. Bu 3D modeli temel amacı yerli mikroçevreyi korumak için olduğundan, hiçbir yapay ECM matris substrat kullanılmıştır.
Özet olarak: reseksiyon örneklerinden eşit steril bir ortamda kesilir ve nitrocellular zarlar üzerine yerleştirilir. Enjeksiyon yoluyla yönetilmektedir tedavi gerekiyorsa onlar membranın yerleştirilmiş sonra dokular enjekte edilir. Tedavi inj ile idare edilecek gerektirmiyorsaection daha sonra, bileşik (% 1 fetal buzağı serumu (FCS),% 1 penisilin-streptomisin (P / S), Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)) kültür ortamına ilave edilir. Daha önce tarif edildiği gibi 5 kültürleri,% 30 sukroz çözeltisi ile işlenmiş doku% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde sabitlenir ve bundan sonra on gün kadar, OCT bileşiği içine gömülmüş ve -80 ° C'de saklandı tutulur.
Protocol
Representative Results
Discussion
ex vivo insan bağ dokusu kültürleme en kritik adımlar canlılığı sağlamak için cerrahi müdahaleden sonra dokusunun hemen kullanımı vardır; Doku her zaman orta ya da tuzlu su çözeltisi içinde kalmalıdır; steril kültür korumak; doku enine kesitleri en fazla 200 mikron kalınlığına sahip olmalıdır; Doku ortamı ile temas içinde olan, ancak tamamen su olmadığında, ex vivo kültür sistemi kurmak en uygunudur. Orta sadece küçük bir hacim içinde transwell dış bölme (ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45um pore size, 12mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti- α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24x60mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76x26mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren’s disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren’s disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren’s disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren’s disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren’s disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren’s Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. r. u. i. t. h. o. f. -. Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren’s nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
