पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) परिधीय तंत्रिका तंत्र के संवेदी न्यूरॉन्स युक्त संरचनाओं हैं। अलग है, वे चोट स्थल पर vivo वातावरण में नकल उतार, इन विट्रो तंत्रिका उत्थान और myelination अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल उपलब्ध कराने, अनुसूचित जाति-तरह वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एएससी) के साथ सह सुसंस्कृत हो सकता है।
Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.
परिधीय तंत्रिका चोटों ब्रिटेन में लगभग 9,000 मामलों में एक मुख्य रूप से युवा में हर साल होने वाली है और जनसंख्या एक काम करने के साथ आम हैं। Microsurgical तंत्रिका मरम्मत तकनीकों के बावजूद, समारोह के सामान्य बहाली बिगड़ा हाथ सनसनी, कम मोटर समारोह और अक्सर दर्द और ठंड असहिष्णुता दो जिसके परिणामस्वरूप के साथ अप्राप्य है। ऐसी चोटों एक गहरा और स्थायी मरीज पर प्रभाव और कम से कम 60% 3 काम पर लौटने के साथ, दैनिक जीवन की गतिविधियों प्रदर्शन करने की क्षमता है।
चोट, फेनोटाइप और न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान और श्वान कोशिकाओं अक्षतंतु अंकुरण की अनुमति के लिए एक उपयुक्त माहौल बनाने के क्रम में (अनुसूचित जाति) परिवर्तन के बाद। Transection के मामले में, तंत्रिका प्रॉक्सिमल और बाहर स्टंप में बांटा गया है; पुनर्योजी प्रक्रिया बाहर का स्टंप, जबकि जगह लेता है जहाँ से बात की जा रही समीपस्थ स्टंप अनुसूचित जाति अलग जिस Wallerian अध: पतन से होकर गुजरती हैघायल एक्सोन, डे-अंतर और पैदा करना है। इस माइलिन मलबे को हटाने और तंत्रिका पुनः पीढ़ी 4,5 के लिए बाहर का स्टंप की तैयारी की दिशा में मौलिक है। एक्सोन अंकुरण बाहर का स्टंप पर अनुसूचित जाति द्वारा जारी neurotrophic कारकों और chemokines के उत्पादन के द्वारा समर्थित है, और Wallerian अध: पतन 6,7 निम्नलिखित पीछे छोड़ दिया बेसल लामिना द्वारा निर्देशित है। अनुसूचित जाति Büngner के बैंड के गठन regenerating अक्षतंतु, साथ संरेखित जो सहायता endoneurial ट्यूब के बाहर शाखाओं में बंटी को कम करने के लक्ष्य अंग की ओर अक्षतंतु विकास,। Reinnervation के बाद, अनुसूचित जाति पुनर्जीवित एक्सोन लपेटकर नई माइलिन आवरण रूप है, लेकिन संवेदी और मोटर समारोह केवल आंशिक रूप से 8 बहाल है।
पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) संवेदी neuronal कोशिकाओं परिधीय अंगों innervating युक्त स्पाइनल कॉलम की कशेरुकाओं foramina में स्थित संरचनाओं, कर रहे हैं। अलग करते हैं, वे एक उपयुक्त इन विट्रो मॉड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैमाइलिन गठन की जांच सहित 11 – तंत्रिका पुनर्जनन 9 के अध्ययन के लिए एल। विशेष रूप से, वयस्क DRG न्यूरॉन्स इन कोशिकाओं के vivo विशेषताओं की नकल और ऊतक इंजीनियरिंग में परिधीय तंत्रिका मरम्मत के लिए नई रणनीति का अध्ययन करने के लिए एक दुर्जेय उपकरण प्रदान करते हैं।
सह-संस्कृतियों इन विट्रो में एक विशेष रूप से दो (या अधिक) सेल प्रकार की परस्पर क्रिया में विवो पर्यावरण simulates एक गतिशील प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन सेल सह संस्कृति मॉडल के फायदों में से एक बाह्य वातावरण पर exerted किया जा सकता है कि लचीलापन और उच्च नियंत्रण है। 14 – DRG न्यूरॉन्स परिधीय तंत्रिका तंत्र 10,12 में दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच होती है कि वास्तविक बातचीत की नकल करने के सुप्रीम कोर्ट के साथ सह संस्कृति प्रणालियों में अक्सर इस्तेमाल किया गया है। यह अनुसूचित जाति बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन और उल्लेखनीय सुधार कर सकते हैं कि विकास के कारकों का स्राव कि प्रदर्शन किया गयाDRG न्यूरॉन्स की क्षमता और जीवित रहने के neurites 15,16 अंकुरित करने के लिए। हालांकि, अनुसूचित जाति सेल कल्चर तकनीक के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, यह ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं का एक उपयुक्त संख्या उत्पन्न करने के लिए अभी भी कठिन है, पैदा करने के लिए समय की लंबी अवधि की आवश्यकता होती है और। इसके अलावा, एक स्वस्थ तंत्रिका के बलिदान ऑटोलॉगस अनुसूचित जाति फसल के लिए जरूरी हो जाता है। इसलिए, सोर्सिंग अनुसूचित जाति में अंतर दोनों ऊतक इंजीनियरिंग के लिए और तंत्रिका उत्थान के लिए इन विट्रो परीक्षण में महत्वपूर्ण है। इस दृश्य में, ए एस सी परिधीय तंत्रिका मरम्मत 17,18 के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक ऊतक इंजीनियर निर्माण के विकास के लिए एक मूल्यवान विकल्प पर विचार किया जा सकता है। पिछले काम में इस तरह के एस -100, P75 और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) 19, साथ ही माइलिन प्रोटीन शून्य (P0) के रूप में विशेषता glial-मार्करों, 20 को व्यक्त करने, अनुसूचित जाति-तरह एएससी में अंतर करने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता का प्रदर्शन । ऐसे मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक के रूप में glial वृद्धि कारकों, के स्राव (BDNF), तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) और glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic कारक (GDNF) भी 21,22 मनाया गया। 26 – इन विट्रो में दोनों ने प्रदर्शन किया और इन विवो में 23 अध्ययन के रूप में इसलिए, अनुसूचित जाति-जैसे ए एस सी, परिधीय तंत्रिका उत्थान के प्रमोटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, ए एस सी अन्य स्टेम सेल प्रकार की तुलना में अधिक संख्या में न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के माध्यम से काटा जा सकता है; वसा ऊतकों में स्टेम कोशिकाओं की आवृत्ति 100 करने के लिए अस्थि मज्जा 27 की तुलना में अधिक 1,000 गुना है, और वे अनुसूचित जाति और अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की तुलना में एक उच्च प्रसार दर है।
इस काम क्रमशः अलग DRG न्यूरॉन्स और ए एस सी की उच्च कुशल फसल प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, बाद अनुसूचित जाति-तरह की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा रहा है प्रदान करना है। इन दो प्रकार की कोशिकाओं के सह संस्कृति इसलिए DRG के पूर्वोत्तर की क्षमता पर भविष्य के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक बहुत ही व्यावहारिक प्रणाली प्रदान करेगाurons neurites और तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग के लिए अलग पाड़ पर माइलिन के गठन के तंत्र अंकुरित करने के लिए।
प्राथमिक संस्कृति विवो में axotomy के बाद न्यूरॉन्स के उत्थान का अध्ययन करने के लिए DRG न्यूरॉन्स अक्सर neuronal कोशिकाओं के बीच किया जाता है। यहाँ वयस्क चूहों से DRG के फसल के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल न्यूरोनल अस्तित्व समझौता किए बिना आसपास के वातावरण में उपग्रह कोशिकाओं की आबादी को कम करने के उद्देश्य से, प्रस्तुत किया है। एक अनुसूचित जाति की तरह फेनोटाइप में भेदभाव ए एस सी के रूप में सेल उपचार के लिए अनुसूचित जाति के लिए एक वैध विकल्प हैं, एक अनुसूचित जाति की तरह ए एस सी / DRG के सह संस्कृति प्रणाली को भी विस्तार से वर्णन किया गया है।
33 – यह व्यापक रूप से laminin (या laminin के व्युत्पन्न पेप्टाइड दृश्यों) न्यूरॉन अस्तित्व और neurite गठन 31 पर एक लाभदायक प्रभाव है कि जाना जाता है। DRG न्यूरॉन संस्कृतियों जब प्रदर्शन कर यह इसलिए neuronal कोशिकाओं की कार्यक्षमता के किसी भी नुकसान से बचने के क्रम में पहले से कोट करने के लिए laminin के साथ प्रत्येक सब्सट्रेट की सलाह दी है। laminin कोटिंग्स की अवधारणा भी की डिजाइन के लिए biomaterial substrates के लिए लागू होता हैऐसे पाली के रूप में ऊतक इंजीनियरिंग निर्माणों, – caprolactone (पीसीएल) अक्सर तंत्रिका conduits के 30 के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, पिछले काम आतंच matrices के तीन आयाम 11 में neuronal संस्कृतियों के लिए उपयुक्त सामग्री रहे हैं कि प्रदर्शन किया।
प्रोटीन कोटिंग के अलावा, सह संस्कृति मॉडल DRG न्यूरॉन अस्तित्व और चोट के बाद परिधीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स और अनुसूचित जाति के बीच होती है कि बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त वातावरण के लिए बहुमूल्य शर्तों प्रदान करते हैं। कोशिकाओं को भी चोट स्थल पर ऑटोलॉगस कोशिकाओं की भर्ती के समय कम करने के क्रम में तंत्रिका उपकरणों का उपयोग करके विवो में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। यह सेल वार्धक्य / मृत्यु और मांसपेशियों शोष को जन्म दे सकता है जो गंभीर चोटों, में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अनुसूचित जाति परिधीय तंत्रिका उत्थान और myelination, अपने सीमित उपलब्धता और उनके धीमी गति से प्रसार दर की प्रक्रिया में शामिल सबसे महत्वपूर्ण glial कोशिकाओं हालांकि उन्हें अनुपयुक्त बनाता हैऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के 34 के लिए। ए एस सी की वजह से उनकी बहुतायत और अनुसूचित जाति फेनोटाइप में अंतर करने की क्षमता, विशिष्ट glial मार्करों व्यक्त और देशी अनुसूचित जाति के लिए 19 कार्यात्मक समानता दिखाने के लिए एक वैध विकल्प हैं। ए एस सी भी एक सह संस्कृति प्रणाली में DRG न्यूरॉन्स द्वारा गठन और neurites की विस्तार करने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि प्रोटीन और वृद्धि कारकों 5 का उत्पादन करने में सक्षम हैं। हालांकि, दो अलग अलग सह संस्कृति प्रणालियों प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के समारोह के रूप में स्थापित किया जा सकता है। इस पत्र में प्रस्तावित विधि हमारी प्रयोगशाला में 11 में एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण है और यह दूसरा सेल प्रकार (DRG न्यूरॉन्स) वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जिसमें दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच सीधा संपर्क (प्रत्यक्ष सह संस्कृति), शामिल है दूसरों (अनुसूचित जाति-तरह एएससी) के शीर्ष पर। यह दृष्टिकोण neuronal संस्कृतियों 35 बोने जब सब्सट्रेट पर एक glial सेल परत की उपस्थिति के महत्व को दिखा दिया कि पिछले निष्कर्ष पर आधारित है <sup> – 37। इस आशय की स्टेम कोशिका की सतह पर ए एस सी और अन्य संकेतों से जमा DRG integrins के माध्यम से सेल सेल बातचीत और ईसीएम अणुओं की वजह से होने की संभावना है। यह भी माध्यम में प्रोटीन सीरम की कमी एएससी कार्यों को प्रभावित किए बिना, DRG न्यूरॉन्स की हदबंदी से प्राप्त कर सकते हैं कि उपग्रह कोशिकाओं contaminating के प्रसार को कम किया है कि मनाया गया। हालांकि, अनुसूचित जाति की एक छोटी सी आबादी सहित उपग्रह कोशिकाओं, पूरी तरह से भी सह संस्कृति प्रणाली में उपस्थित रहेंगे DRG न्यूरॉन्स और कुछ शेष कोशिकाओं की संस्कृतियों से खत्म करने के लिए मेहनत कर रहे हैं। यह इन छोटे उप आबादी भी चोट के बाद विवो में मौजूद हैं कि ऑटोलॉगस कोशिकाओं को वापस बुलाने, इन विट्रो अध्ययन के दौरान myelination प्रक्रियाओं को शामिल कर सकते हैं कि नोट करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। दूसरा दृष्टिकोण (यहाँ प्रस्तुत नहीं) दो अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के बीच सीधा संपर्क (अप्रत्यक्ष सह संस्कृति) से परहेज, सेल संस्कृति आवेषण का इस्तेमाल शामिल है। Howevएर, यह तंत्रिका पुनर्जनन (लंबी neurites विकसित करने के लिए neuronal कोशिकाओं की कम क्षमता) के दौरान इन विवो शर्तों के प्रतिनिधि नहीं है, लेकिन यह अन्य 38 पर एक निश्चित सेल की आबादी से मध्यम में जारी प्रसारण कारकों के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
15 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
50 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml | |
Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 | |
Petri dishes | Corning | 430165 | |
Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |