背根神经节(DRG)是含有外周神经系统的感觉神经元的结构。当解离,它们可以是共培养的SC状脂肪来源的干细胞(ASC),提供了一个有价值的模型来研究在体外神经再生和髓鞘形成,模仿体内环境在损伤部位。
Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.
周围神经损伤是常见的发生在每年的一个主要年轻约9000例,英国和就业人口1。尽管显微神经修复技术,功能恢复正常是不可能实现的与造成损害的手的感觉,减少运动功能和频繁的疼痛和不耐低温2。这种伤害对病人深刻而持久的影响,他们进行日常活动,用了不到60%的恢复工作3能力。
损伤后,表型和神经元的形态和雪旺细胞(SC),以创造一个合适的环境,以允许轴突出芽变化。如果横断,神经分为近端和远端树桩;近端残端是从再生过程发生,而远端残端点经历沃勒变性于是SC分离从受伤的轴突,脱分化和增殖。这是对消除髓鞘碎片和准备远端残端神经再生成4,5根本。轴突出芽被生产在远端残端释放的SC神经营养因子和趋化因子的支持,并通过基底层留下以下沃勒变性6,7导向。 SC对准旁边的再生轴突形成Büngner的乐队,其中援助轴突生长朝着靶器官,减少神经内膜管外的分支。以下再支配,SC形成新的髓鞘包裹再生轴突,但感觉及运动功能仅部分恢复8。
背根神经节(DRG)是位于脊柱的椎间孔结构,含有该感官神经元细胞支配周围器官。当解离,它们可以作为一个合适的体外模埃尔神经再生9的研究– 11,包括髓鞘形成调查。特别是成年DRG神经元模拟体内的特点,这些细胞,并提供了一个强大的工具来研究周围神经修复组织工程的新战略。
共培养物表示一个动态系统,它模拟在体外两个(或多个)细胞类型中特定的相互作用的体内环境。其中的一个细胞共培养模型的一个优点是灵活性和高的控制,可以在细胞外环境中发挥。 DRG神经元已被经常使用在共培养系统的SC以模仿在周围神经系统10,12的两种细胞类型之间发生的实际相互作用– 14。由此表明了SC分泌胞外基质(ECM)蛋白和生长因子,能显着提高DRG神经元的存活能力和萌芽突起15,16。然而,SC需要的时间长的期间的增殖,尽管在细胞培养技术的进步,但仍难以产生细胞用于组织工程应用的一个适当的数目。此外,一个健康的神经的牺牲是必要收获自体SC。因此,在采购SC的差为组织工程和在神经再生的体外测试重要。在此视图中,ASC可以被认为是有价值的替代的组织工程化构建体的发展,以用于外周神经修复17,18。先前的工作证明了这些细胞分化成的SC状的ASC的能力,表达特性胶质标记物,如S-100,P75,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)19,以及髓磷脂蛋白零(P0)20 。的胶质生长因子,如脑源性神经营养因子的分泌(BDNF),神经生长因子(NGF)和神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),也观察到21,22。因此,SC-像ASC可用作外周神经再生的启动子,如在体外证明既和体内研究23 – 26。此外,ASC可以通过在更高的数目相比于其它干细胞类型的微创程序收获;干细胞的脂肪组织中的频率为100至1000倍,比在骨髓27更高,并且它们具有较高的增殖率相比,SC和骨髓间充质干细胞。
这项工作的目的是提供一个详细的协议分别进行分离DRG神经元和ASC高效率的收获,后者分化为SC样细胞。因此这两种细胞类型的共培养将提供可用于未来的研究上的DRG网元的能力非常实用的系统urons发芽轴突和不同的支架用于神经组织工程髓鞘的形成机制。
DRG神经元经常用于神经元细胞中进行原代培养,以干切断体内后研究神经元的再生。这里的精确协议DRG收获从成年大鼠被提出,其目的是减少卫星细胞中周围环境的人口不损害神经元的存活。作为ASC分化成的SC样表型是一个有效的替代方案的SC用于细胞疗法中,SC-像ASC / DRG共培养系统也进行详细说明。
它被广泛已知昆布氨酸(或层粘连蛋白来源的肽序列)对神经元的存活和神经突的形成31的有益效果– 33。当执行的DRG神经元培养它因此宜预先涂覆每个衬底与层粘连蛋白,以避免的神经元细胞的功能性的任何损失。层粘连蛋白涂层的概念也适用于生物材料底物的设计组织工程构建体,如聚-己内酯(PCL)经常用于神经导管30的制造。此外,先前的工作表明,纤维蛋白基质以3维11的合适的材料的神经元培养物。
除了蛋白质涂层,共培养模型提供了对DRG神经元的存活和合适的环境以研究以下损伤的神经元和SC在周围神经系统之间发生的相互作用有价值的条件。细胞也可以通过以缩短在损伤部位的自体细胞的募集时间利用神经移植装置在体内 。这是严重的损伤,从而导致细胞衰老/死亡和肌萎缩特别重要。虽然SC是参与外周神经的再生和髓鞘形成,其有限的可用性和它们的慢扩散率的过程中最重要的神经胶质细胞,使它们不适合用于组织工程的应用34。 ASC是一个有效的替代,由于其丰度和能力分化成使SC表型,表达特定神经胶质标记物,并示出功能上的相似,以天然的SC 19。 ASC也能够产生蛋白质和生长因子5,其可以是形成和延伸突起由DRG神经元中的共培养系统是有益的。然而,两种不同的共培养系统可被设置为的实验需要的功能。在本文所提出的方法是在我们的实验室11一既定协议的修订版本,它涉及( 直接共培养 )的两种细胞类型之间的直接接触,其中,所述第二细胞类型(DRG神经元)接种上的其他人(SC状ASC)的顶部。这种方法是基于先前的发现接种神经元培养35时表现出了胶质细胞层的衬底上的存在的重要性<sup> – 37。这种效果可能是由于通过DRG整从ASC和其他线索沉积在干细胞表面细胞 – 细胞相互作用和细胞外基质的分子。还观察到该蛋白的血清的培养基中的减少降低了污染的卫星细胞,它可以从DRG神经元的解离获得的增殖,而不影响ASC功能。然而,卫星细胞,包括一小口的SC,是很难从DRG神经元和少剩余的细胞的培养物完全消除也将存在于该共培养体系。因此,重要的要注意的是,这些小亚群也可以参与到髓鞘过程中的体外研究,回顾了自体细胞中存在的体内损伤后。第二种方法(此处未呈现)涉及使用细胞培养插入,避免( 间接共培养 )的两种不同的细胞类型之间的直接接触。 Howev呃它不是代表的神经再生(神经元细胞的发育神经突长能力降低)在体内的条件,但它是用来释放扩散因子的培养基中按一定的细胞群的影响进行调查到其他38 。
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
15 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
50 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml | |
Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 | |
Petri dishes | Corning | 430165 | |
Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |