Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
A microscopia confocal é o método de escolha para a análise da localização de vários tipos de células presentes nos tecidos complexos, tais como a medula óssea. No entanto, a análise e quantificação de localização celular é difícil, já que em muitos casos, depende de contagem manual, tendo, assim, o risco de introduzir um viés dependente avaliadores e reduzindo a confiabilidade entre examinadores. Além disso, muitas vezes é difícil avaliar se a co-localização entre duas células resulta de posicionamento aleatório, especialmente quando tipos de células diferem fortemente da frequência de sua ocorrência. Aqui, um método para a quantificação isenta de co-localização celular na medula óssea é introduzido. O protocolo descreve a preparação da amostra para se obter secções histológicas de ossos longos de murino inteiros, incluindo a medula óssea, bem como o protocolo de coloração e a aquisição de imagens de alta-resolução. Um fluxo de trabalho de análise que vai desde o reconhecimento da hematopoiética e não hemattipos de células opoietic em 2 dimensões imagens de medula (2D) osso para a quantificação dos contactos directos entre as células é apresentado. Isto também inclui uma análise de vizinhança, para se obter informações sobre o microambiente celular em torno de um determinado tipo de célula. A fim de avaliar se a co-localização dos dois tipos de células é a mera função do posicionamento de célula ou aleatório reflecte associações preferenciais entre as células, uma ferramenta de simulação, que é adequado para testar esta hipótese, no caso de células hematopoiéticas, assim como as células do estroma, é utilizado. Esta abordagem não é limitada para a medula óssea, e pode ser alargado a outros tecidos para permitir a análise reprodutível, quantitativa dos dados histológicos.
Introduction
Devido a recentes desenvolvimentos tecnológicos rápidos na microscopia, incluindo imageamento óptico, a análise de células dentro do contexto de todo o tecido tornou-se cada vez mais acessível para os imunologistas. A caracterização de células individuais em suspensão representa um método valioso e indispensável para compreender a função celular e molecular. No entanto, a análise das células dentro do seu (micro) -anatomical ambiente é essencial para a compreensão das interacções entre os vários tipos de células que colaboram com os processos complexos, tais como o desenvolvimento de respostas imunitárias.
Embora seja relativamente fácil para os microscopistas para obter informações qualitativas a partir de imagens, continua a ser um desafio para quantificar esses dados, em parte devido ao fato de que os métodos de análise neste domínio estão ficando para trás em comparação com o que é possível na aquisição de imagem. Muitos pesquisadores ainda dependem de contagem manual de células em suas imagens de histologia demorado,introduzindo assim uma polarização entre diferentes avaliadores e impedindo a replicação por outros grupos. Muitas vezes, uma imagem representativa é escolhido para sublinhar uma declaração sobre a posição celular ou co-localização em uma publicação, tornando-se difícil para o leitor a julgar a relevância estatística de um evento como esse.
Juntamente com o fato de que o conteúdo de informação completa de dados de imagem são raramente exploradas, que enfatiza a necessidade de uma abordagem mais imparcial, mais rápido e abrangente para analisar imagens histológicas.
A medula óssea é um tecido complexo, que assume as funções vitais importantes como o órgão de hematopoiese em vertebrados adultos. Além de ser o local de nascimento de células hematopoiéticas 1,2 e desempenhando um papel importante no desenvolvimento de linfócitos B 3, ele também atua como um local onde as reações imunológicas são iniciados 4 e apoia, células de recirculação B maduras 5. Além disso, o seu papel na manutenção da imemória mmunological tornou-se cada vez mais apreciado na última década, como vários tipos de células que constituem a memória imunológica, foram encontrados para residir 6-9.
A relação entre a arquitetura complexa do tecido da medula óssea e as suas funções ainda permanece elusiva. Ao contrário de órgãos linfóides secundários, que são organizadas em macro-compartimentos tais como zonas de células T e B, a medula óssea não tem uma macro-compartimentalização clara. Até agora compartimentos distintos na medula óssea são definidos, pela sua proximidade ao córtex do osso ou a vasculatura. A importância das várias populações de células do estroma residentes na medula óssea para um número de processos tais como células estaminais, que suportam o desenvolvimento de células B ou a manutenção de populações de células de memória imunes (tais como células plasmáticas durabilidade (PCs), CD4 + e CD8 +, células T da memória) indica claramente que existe um certo grau de micro-compartimentalização na medula óssea.
<pclasse = "jove_content"> Estas observações levaram ao conceito de nichos microanatômico distintas, que são especializados em certas funcionalidades (manutenção de células estaminais, o desenvolvimento de células B em várias fases, e manutenção de memória imunológica) na medula óssea. Embora pareça haver um certo grau de heterogeneidade entre os nichos que servem funções diferentes, alguns dos factores produzidos pelas células estromais, tais como ligando de quimiocina CXC-12 (CXCL12) ou a interleucina 7 (IL-7), são componentes cruciais para vários desses nichos 10. A visualização e caracterização de células do estroma da medula óssea é difícil devido às suas características morfológicas, com extensões dendríticas longos e finos formando uma rede em toda a medula óssea, e a falta de marcadores apropriados para discriminar subpopulações estromais.Ainda não está claro até que ponto esses nichos partilham características comuns em relação à sua compositio celular e molecularn, e que elementos tornar um determinado nicho único. Para além das células do estroma, os tipos de células hematopoiéticas tenham sido mostrado desempenhar um papel crucial, fornecendo certos sinais de, pelo menos, para alguns dos nichos. Claramente, a complexidade da composição nicho requer sua análise in situ, e tornou-se cada vez mais importante para imunologistas e hematologistas para aumentar o zoom na microarquitetura de medula óssea, por exemplo, analisando as relações espaciais entre seus componentes celulares.
Aqui, uma estratégia para quantificar co-localização e de vizinhança relações celulares na medula óssea de uma forma automática e imparcial é apresentado. Um fluxo de trabalho detalhadas, incluindo a geração de camundongos quiméricos, que abriga as células fluorescentes estromais e células hematopoiéticas não fluorescentes, preparação de cortes histológicos de ossos não descalcificadas, aquisição de imagens confocal que cobrem o osso inteiro, bem como a análise de imagem automatizado de c celularo-localização e a sua validação / discriminação de posicionamento aleatório por uma ferramenta de simulação é fornecida (Figura 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar dos avanços nos métodos de imagem óptica modernos, a análise dos dados histológico ainda é muitas vezes dificultada pela falta de ferramentas adequadas e métodos de quantificação, ou por análises tendenciosas que se concentram em uma pequena área de interesse. A abordagem sinérgica aqui apresentada combina análise de imagem cobrindo toda a região de medula óssea, a segmentação automatizada e detecção de objectos de vários tipos de células hematopoiéticas e estromais, análise de co-localiza?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Andreas Radbruch pelas valiosas discussões. Somos gratos a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann e Manuela Ohde para assistência com cuidados com os animais e Robert Günther para excelente assistência técnica. Agradecemos aos nossos avaliadores treinados Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache e Katharina Chifre para avaliação das amostras histológicas e Randy Lindquist para revisão do manuscrito. Agradecemos J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, EUA para anticorpos MBP-específicas.
Este trabalho foi apoiado por DFG HA5354 / 4-1, por JIMI-a concessão da rede facilidade DFG núcleo para microscopia intravital e por TRR130 / TP17, e DFG PARA 2165 (HA5354 / 6-1) para AEHSZ foi apoiado pelo Max Planck Internacional Escola de Doenças Infecciosas e Imunologia (IMPRS-IDI), Berlim.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
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