A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Konfokalmikroskopi er metoden for valg for analyse av lokalisering av flere celletyper innenfor komplekse vev som benmargen. Imidlertid er analyse og kvantifisering av cellulær lokalisering vanskelig, som i mange tilfeller er avhengig av manuell telling, og dermed bærer risiko for å innføre en rater avhengig forspenning, og reduserer pålitelighet mellom. Dessuten er det ofte vanskelig å bedømme om ko-lokalisering mellom to celler resulterer fra tilfeldig posisjonering, særlig når celletyper avviker sterkt i hyppigheten av forekomsten. Her er en fremgangsmåte for objektiv kvantifisering av celle co-lokalisering i benmargen innført. Protokollen beskriver prøven oppkjøpet av bilder med høy oppløsning preparat som brukes for å skaffe histologiske snitt av hele murine lange bein inkludert benmargen, samt farging protokollen og. En analyse arbeidsflyt spenner fra anerkjennelsen av blodkreft og ikke-Hematopoietic celletyper i to-dimensjonale (2D) benmargs bilder til kvantifisering av de direkte kontakter mellom disse cellene blir presentert. Dette inkluderer også et nabolag analyse, for å få informasjon om den cellulære mikromiljøet rundt en bestemt celletype. For å evaluere hvorvidt ko-lokalisering av to celletyper er det bare på grunn av tilfeldig celle posisjonering eller reflekterer gunstige forbindelser mellom cellene, et simuleringsverktøy som er egnet til å teste denne hypotesen i tilfelle av hematopoetiske samt stromale celler, er anvendes. Denne fremgangsmåten er ikke begrenset til benmargen, og kan utvides til andre vev for å tillate reproduserbare, kvantitativ analyse av histologiske data.
Med hensyn til det siste hurtige utvikling innen mikroskopi, inkludert optisk imaging, har analyse av cellene i sammenheng med hele vevet blitt stadig tilgjengelig for immunologer. Karakteriseringen av enkeltceller i suspensjon representerer en verdifull og uunnværlig metode for å forstå cellulære og molekylære funksjon. Det er imidlertid viktig for forståelsen av interaksjonen mellom forskjellige celletyper som samarbeider i komplekse prosesser som for eksempel utvikling av immunresponser analyse av cellene i deres (mikro) -anatomical miljø.
Mens det er relativt enkelt for microscopists å innhente kvalitativ informasjon fra bilder, er det fortsatt en utfordring å kvantifisere disse dataene, delvis på grunn av det faktum at metoder analyse på dette området henger etter i forhold til hva som er mulig i bildet oppkjøpet. Mange forskere fortsatt stole på tidkrevende manuell celletelling i sine histologi bilder,dermed innføre en skjevhet blant ulike raters og hindre replikering av andre grupper. Ofte, en representant bilde valgt å understreke en uttalelse på mobil stilling eller samlokalisering i en publikasjon, noe som gjør det vanskelig for leseren å bedømme den statistiske relevansen av en slik hendelse.
Sammen med det faktum at den fulle informasjonsinnholdet i bildedata sjelden utnyttes, understreker dette behovet for en mer objektiv, raskere og omfattende tilnærming for å analysere histologiske bilder.
Benmargen er en kompleks vev, som tar på viktige vitale funksjoner som organ for hematopoiesen hos voksne virveldyr. Foruten å være fødestedet for blodkreft cellene 1,2 og spiller en viktig rolle i B-lymfocytter utvikling 3, fungerer det også som et sted hvor immunreaksjoner er initiert fire og støtter modne, resirkulerende B-celler fem. I tillegg er dets rolle i å opprettholde immunological minne har blitt stadig mer verdsatt i det siste tiåret, som flere typer celler som utgjør immun minne har blitt funnet å oppholde seg der 6-9.
Forholdet mellom den komplekse vevsarkitektur av benmargen og dens funksjoner fortsatt unnvikende. I motsetning til sekundære lymfoide organer, som er organisert i makro avdelinger som T- og B-celle-soner, mangler benmargen en klar makro compartmentalization. Så langt forskjellige avdelinger i benmargen er definert av deres nærhet til beinet cortex eller blodkar. Betydningen av de forskjellige hørende stromale cellepopulasjoner i benmargen for en rekke prosesser som støtter stamceller, utvikling av B-celler eller vedlikehold av immunminnecellepopulasjoner (slik som langvarige plasmaceller (PC-er), CD4 + og CD8 + T-celler minne) viser klart at det er en viss grad av mikro-compartmentalization i benmargen.
<pclass = "jove_content"> Disse observasjonene har ført til begrepet distinkte microanatomical nisjer, som er spesialisert på visse funksjoner (stamcelle vedlikehold, B-celle utvikling på ulike stadier, og vedlikehold av immunologisk hukommelse) i benmargen. Selv om det synes å være en viss grad av heterogenitet blant nisjer som tjener forskjellige funksjoner, og noen av de faktorer som produseres av stromale celler, slik som CXC-kjemokin-ligand 12 (CXCL12) eller interleukin 7 (IL-7), er viktige komponenter for flere av disse nisjene 10. Visualisering og karakterisering av stromale celler i benmargen er vanskelig på grunn av deres morfologiske funksjoner med lange, tynne dendrittiske utvidelser danner et nettverk over hele benmargen, og mangelen på egnede markører for å diskriminere stromal subpopulasjoner.Det er ennå ikke klart i hvilken grad disse nisjene dele fellestrekk med hensyn til deres cellulært og molekylært composition, og hvilke elementer gjengi en viss nisje unik. I tillegg til stromale celler, hematopoetiske celletyper har vist seg å spille en avgjørende rolle ved å tilveiebringe visse signaler i hvert fall for noen av nisjene. Åpenbart kompleksiteten i nisje sammensetning krever sin analyse in situ, og det har blitt stadig viktigere for immunologer og Hematologer å zoome inn på benmargen mikroarkitektur, f.eks, ved å analysere romlige relasjoner mellom sine cellulære komponenter.
Her, til en strategi kvantifisere cellulære samlokalisering og nabolag relasjoner i benmargen i en automatisert og objektiv måte er presentert. En detaljert arbeidsflyt inkludert generering av kimære mus, husing fluorescerende stromale celler og ikke-fluorescerende hematopoetiske celler, fremstilling av histologiske seksjoner fra undecalcified bein, anskaffelse av konfokale bilder som dekker hele benet, samt den automatiserte bildeanalyse av cellulær co-lokalisering og dens validering / diskriminering fra tilfeldig posisjonering av et simuleringsverktøy er gitt (Figur 8).
Til tross for fremgang i moderne optiske avbildningsmetoder, er analysen av histologiske data fortsatt ofte hindret av mangel på skikkelig kvantifisering verktøy og metoder, eller av forutinntatte analyser som fokuserer på et lite område av interesse. Den synergistisk tilnærming som presenteres her kombinerer bildeanalyse som dekker hele benmargen regionen, automatisert segmentering og objekt anerkjennelse av ulike blodkreft og stromal celletyper, samlokalisering analyse, og til slutt en valideringsverktøyet av ik…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andreas Radbruch for verdifulle diskusjoner. Vi er takknemlige for Sabine Gruczek, Patrick Thiemann og Manuela Ohde for å få hjelp med dyr omsorg og Robert Günther for utmerket teknisk assistanse. Vi takker våre opplærte raters Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Firenze Pache og Katharina Horn for evaluering av histologiske prøver og Randy Lindquist for korrekturlesing av manuskriptet. Vi takker J. og N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA for MBP-spesifikke antistoffer.
Dette arbeidet ble støttet av DFG HA5354 / 4-1, av Jimi-en DFG kjernefasiliteten nettverk stipend for intramikroskopi og ved TRR130 / TP17, og DFG FOR 2165 (HA5354 / 6-1) til AEHSZ ble støttet av den internasjonale Max Planck skole for infeksjonssykdommer og immunologi (IMPRS-IDI), Berlin.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
Dry ice | |||
Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |