Immunohistokemi og Multiple Mærkning med antistoffer fra den samme vært Arter at studere Voksen Hippocampal Neurogenese
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Adult neurogenesis er en stærkt reguleret, multi-trins proces, hvor nye neuroner er genereret ud fra en aktiveret neural stamcelle via stigende engagerede mellemliggende progenitor undertyper. Hver af disse undertyper udtrykker et sæt specifikke molekylære markører, der sammen med specifikke morfologiske kriterier, der kan bruges til at identificere dem. Typisk er immunfluorescerende teknikker anvendes involverer undertype-specifikke antistoffer i kombination med exo- eller endogene proliferationsmarkører. Heri beskrives immunolabeling metoder til påvisning og kvantificering af alle stadier af voksne hippocampus neurogenese. Disse omfatter anvendelsen af thymidinanaloger, transcardial perfusion, væv forarbejdning, varme epitopgenfinding, ABC immunhistokemi, flere indirekte immunofluorescens, konfokal mikroskopi og celle kvantificering. Derudover præsenterer vi en sekventiel behandling af flere immunfluorescens protokol, som omgår problemer usually følge af behovet for at anvende primære antistoffer rejst i den samme vært art. Det giver mulighed for en nøjagtig identifikation af alle hippocampus progenitor undertyper sammen med en spredning markør i en enkelt sektion. Disse teknikker er et kraftfuldt værktøj til at studere reguleringen af forskellige progenitor undertyper parallelt, deres deltagelse i hjernen patologier og deres rolle i bestemte hjernefunktioner.
Introduction
To hjerneområder konstitutivt generere nye neuroner i hele livet, den subventrikulære zone af de laterale ventrikler og subgranular zone (SGZ) i hippocampus tandede gyrus (DG). Den nyfødte neuroner stammer fra neurale stamceller og gå gennem forskellige stadier af morfologiske og fysiologiske udvikling, før de når modenhed 1,2. Fra et langsomt dividere radial glia-lignende stamceller (type 1) på hinanden følgende faser af transit uddybning opstår mellemliggende stamceller. De mere udifferentierede undertyper (type 2a og type 2b) har en uregelmæssig form med korte, tangentielle processer. De genererer neuroblasts (type 3), som gradvist forlader cellecyklussen for at blive umodne neuroner (med dendritter forlænget mod molekylære lag) og endelig integreret i hippocampus netværk modne granulceller. På grund af deres særlige fysiologiske karakteristika disse celler giver kredsløbet med forbedrede plasticitet 3 suggesTing en enestående rolle i hippocampus funktion. Faktisk undersøgelser af det sidste årti medført betydelig dokumentation for, at voksne neurogenese bidrager til rumlig hukommelse, mønster separation og følelsesmæssig adfærd 4,5.
Adult neurogenesis kan studeres ved hjælp af forskellige metoder. Thymidinanaloger inkorporere i DNA under S-fase af cellecyklussen og tillade fødslen dating, kvantificering og skæbne analyse af nyfødte celler 6-8. Sekventiel anvendes forskellige thymidinanaloger (f.eks CldU, edu eller IDU) kan bruges til at studere celle omsætning eller cellepopulationer født på forskellige tidspunkter i løbet af et eksperiment 9. En alternativ endogen markør for celleproliferation er Ki67. Det udtrykkes i delende celler i alle faser af cellecyklussen (G1, S, G2, M) bortset hvilefase (G0) og begyndelsen af G1 10,11. For at analysere fænotypen af nyfødte cellepopulationer i den voksne dentate gyrus flere fase-specifikke molekylære markører kan anvendes, såsom GFAP, nestin, DCX og NeuN 1,6. GFAP er en markør af modne astrocytter men kommer også til udtryk i radiale glia-lignende celler i den voksne forhjerne. Nestin er et mellemprodukt filament specifikt for radiale glia-lignende celler og tidlige mellemliggende progenitorceller. DCX er en mikrotubulus-associeret protein udtrykt i mellemliggende stamfædre, neuroblaster og umodne neuroner. Baseret på den (med) ekspression af disse tre markører og morfologiske træk ved de mærkede celler kan identificeres fire forskellige stamceller undertyper: type 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), type 2 a (GFAP -, nestin + , DCX -), type 2 b (GFAP -, nestin +, DCX +) og type 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-mærkning af DCX sammen med NeuN, som udtrykkes i postmitotiske neuroner, tillader differentiering af immature (DCX +, NeuN +) og modne (DCX -, NeuN +) granula neuroner.
De ovennævnte markører anvendes ofte til immunofluorescent co-mærkning og efterfølgende konfokal mikroskopi til at analysere antallet og identiteten af nyfødte celler. Dette kræver typisk antistoffer fra forskellige værtsarter for at forhindre uønsket antistof krydsreaktivitet. Men størstedelen af primære antistoffer er egnede til neurogenese forskning rejses i kaniner eller mus (fx mus α-BrdU, mus α-NeuN, kanin α-Ki67, kanin α-GFAP). Dette fører til alvorlige begrænsninger i antallet og kombinationen af antigener, der kan vurderes på en enkelt skive. Dette vil til gengæld ikke kun øger farvning indsats, som flere farvninger skal udføres, men kan også påvirke resultaternes pålidelighed. Desuden er nogle antigener er modtagelige for formalinfiksering-induceret epitop maskering (f.eks Ki67, Nestin). Vi beskriver heri modifikationer fra de klassiske enkelt- og multiple immunmærkning protokoller (f.eks epitopgenfinding, flere sekventiel immunfarvning, brug af nestin-GFP transgene mus 12), overvinde mange af disse problemer. Især sekventiel multipel immunofluorescens protokol tillader farvning mod op til fire forskellige antigener selv om en del af antistofferne er afledt fra den samme vært. Dette muliggør samtidig påvisning af type 1, type 2a, type 2b og type 3 progenitorceller, samt deres proliferative aktivitet inden for et enkelt afsnit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantificering og identifikation af subpopulationer af nyfødte celler er et centralt spørgsmål i voksen neurogenese forskning. Kombinere proliferationsmarkører og antistoffer mod proteiner udtrykt i bestemte stadier af voksne neurogenese tillader immunhistokemisk påvisning af disse subpopulationer. Nogle af antistofferne eller antistof-kombinationer kræver specifik farvning betingelser.
Mærkning af delende celler med syntetiske thymidinanaloger er stadig den gyldne standard for at stu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
