우리는 busulfan conditioning을 통해 방사선 조사가 없는 상태에서 녹색 형광 단백질을 유비쿼터스하게 발현하는 기증자 마우스의 골수 세포로 대체하는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 중추 신경계의 골수 세포 축적을 연구하는 데 유용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
골수 이식(BMT)은 수혜자 마우스의 골수(BM) 구획을 기증자 마우스에서 분리된 뚜렷한 바이오마커를 발현하는 BM 세포로 대체하는 데 자주 사용됩니다. 이 기술을 사용하면 수용 마우스 내에서 공여자 유래 조혈 세포를 식별할 수 있으며 다양한 생화학적 기술을 사용하여 공여자 세포를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. BMT는 일반적으로 기증자 세포 생착을 위해 수용 마우스의 BM 구획 내에 틈새 공간을 생성하기 위해 전신 방사선 조사를 통한 골수 절제 조건화에 의존합니다. 여기에서 설명하는 프로토콜은 화학요법제인 부설판(busulfan)과 함께 골수억제 조건화(myelosuppressive conditioning)를 사용합니다. 전문 설비를 이용해야 하는 방사선 조사와 달리, 부설판 컨디셔닝은 총 60-100mg/kg의 투여량이 투여될 때까지 20mg/kg 부설판의 복강내 주사를 사용하여 수행됩니다. 더욱이, 골수절제 방사선 조사는 독성 부작용을 일으킬 수 있으며 수용 마우스의 생존을 위해 기증자 세포의 성공적인 생착이 필요합니다. 대조적으로, 이러한 용량을 사용한 부설판 컨디셔닝은 일반적으로 내약성이 우수하며 마우스는 공여자 세포 지원 없이 생존합니다. 공여자 BM 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)을 유비쿼터스하게 발현하는 마우스의 대퇴골 및 경골에서 분리되어 조건화된 수용 마우스의 측면 꼬리 정맥에 주입됩니다. BM 키메라증은 BMT 후 말초 혈액 내 GFP+ 세포의 수를 정량화하여 추정합니다. 키메라 수치 >80%는 일반적으로 이식 후 3-4주 후에 말초 혈액에서 관찰되며 최소 1년 동안 확립된 상태로 유지됩니다. 방사선 조사와 마찬가지로, 부설판과 BMT를 이용한 컨디셔닝은 중추신경계(CNS) 내에서, 특히 신경퇴행의 마우스 모델에서 기증자 BM 유래 세포의 축적을 가능하게 합니다. 이러한 부설판 매개 중추신경계 축적은 부설판 치료가 독성이 적고 중추신경계 염증이 덜 광범위한 것으로 보이기 때문에 전신 조사보다 생리학적으로 더 생리학적일 수 있습니다. 우리는 이 세포가 중추신경계에 치료제를 전달하도록 유전적으로 조작될 수 있다는 가설을 세웠습니다.
서론
최근에는 중추신경계(CNS)에서 미세아교세포와 골수(BM) 유래 세포(BMDC)가 질병 중과 정상적인 노화 기간 동안 하는 역할에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 중추신경계의 상주 면역 세포인 미세아교세포(Microglia)는 현재 배발생(embryogenesis)1 동안 원시 골수성 전구세포(primitive myeloid progenitor)가 진입한 후 중추신경계에서 발달하는 것으로 알려져 있습니다. 미세아교세포는 성인이 될 때까지 골수단핵구 계통의 측면을 잘 유지합니다. 증거는 건강한 성체 동물에서 미세아교세포에 대한 BMDC의 기여도가 미미하다는 것을 시사하지만1, 다양한 신경퇴행성 질환의 진행에서 BMDC가 하는 역할은 불분명합니다. 이러한 불확실성은 보편적으로 받아들여지는 면역조직화학적 마커가 확인되지 않았기 때문에 CNS 내에 축적된 BMDC와 내인성 상주 미세아교세포를 구별하기 어렵다는 사실로 인해 더욱 복잡해집니다. in vivo에서 BMDC를 모니터링하기 위해 당사는 수혜자 마우스의 내인성 BM 세포를 β-actin promoter의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 유비쿼터스하게 발현하는 기증자 마우스의 세포로 대체하는 BM 이식(BMT) 프로토콜을 사용합니다. 이 프로토콜은 면역조직화학을 사용하여 수용 마우스....
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프로토콜
참고 : 윤리 성명 :이 프로토콜을 검토하고 사이먼 프레이저 대학의 동물 관리위원회의 승인을받은 (UACC, 허가 번호 1037K-12와 1060K-03) 및 동물 관리, NIH 가이드에 캐나다 협의회 준수 실험실 동물의 관리 및 사용 및 EEC 이사회 지침.
1. 특별 고려 사항
참고 : 술판은 세포 독성이다. 핸들과 물질 안전 보건 자료 및 제도적 지침에 따라 폐기하십시오.
- 층류 후드에서 무균 기술을 모두 수행한다.
- 이러한 박리 패키지, 오토 클레이브와 같은 적절한 포장 재료에 포장하여 사용 전에기구를 멸균.
- 감염 위험이 조사에 비해 술판 컨디셔닝 낮지 만 이식 후 처음 2 주 층류 후드에서 동물을 처리한다.
2. 컨디셔닝받는 사람 마우스
- 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 ml의 3 ㎎ /에 술판을 희석.
참고 : 주입 매일 사용하기 직전에 부설 판의 신선한 희석을하는 것이 중요합니다. - 매일 IP 주입을 통해받는 사람 마우스에 희석 부설 판의 20 ㎎ / ㎏을 관리합니다.
- 60 ~ 100 mg의 총 ....
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결과
60 ~ 100 mg을 투여 / 부설 판의 kg은 일반적으로 잘 마우스에 의해 허용됩니다. 그러나 동물은 일반적으로 식습관을 격려하기 위해 조사 해바라기 씨 등의 치료와 보완 될 필요가있다 조절 단계 (~ 5 ~ 10 %) 때문에 다이어트 중에 체중을 잃게됩니다. 말초 혈액에서> 80 % GFP + 세포의 키메라와 BM의 수준은 60 ~ 100 ㎎ / ㎏ 부설 판 (7)을 사용하여 지속적으로 달성해야한다. 우리의 실험은 성공적으로 말초 혈액 및 BM에서> 80 % GFP + 세포와 100여 키메라 쥐를 생성하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있으며, 동계 기증자와받는 사람을 사용하는 경우 우리의 BMTs의 거의 모든 성공이다. 그림 1 키메라의 수준이 주간 정량 표시 성공적인 동계 BMT 수용 100 ㎎ / kg으로 조절 술판 마우스의 말초 혈액에서 (N = 3)과 동종 BMT 실패를 수신하는 80 ㎎ / kg으로 조절 술판 마우스 (N = 3). > 80 % 수준.......
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토론
술판 조절은 쉽게 감지 할 수 있습니다 조혈 세포와 생쥐에서 높은 수준의 BM의 키메라의 생성을 허용합니다. 이러한 조절은, 조사 설비를 필요로하지 않고 행할 수있다. 더욱이,이 프로토콜에 설명 술판의 투여 량으로 골수 억제는 잘 조사 골수 투여에 의한 독성 부작용을 최소화 허용하고, 따라서 더 많은 아르 젊은 오래 또는 병에 걸린 마우스에서 BM의 키메라를 생성하기 위해 더 적합한 기술 일 수있다 조사를 골수에 민감. 술판로 달성보다 낮 키메라 레벨을 초래할 수 있으며, 일부 RIC 프로토콜 부작용을 최소화하기 위해 전신 조사 낮은 비 myleoablative 투여 량을 사용하지만, 이러한 프로토콜은 여전히 방사선의 투여 량에 따라, 조사 시설을 필요 에어컨 (13). 최근 treosulfan는 BM 조절 8, 14 사용되어왔다. 술판처럼, treosulfan 컨디셔닝oning 및 BMT는 14 BM 키메라의 고도의 마우스를 생성 할 수있다. 그러나 treosul.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (to KP)와 CIHR, ALS Society of Canada, and Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682)의 CK 및 FMR에 대한 신경근 연구 파트너십 프로그램 보조금의 지원을 받았습니다. 미국 ALS 협회(ALS Society of America, 57969)에서도 추가 지원을 제공했습니다. 캐나다 밴쿠버에 소재한 BC 암청(BC Cancer Agency) 테리 폭스 연구소/병리학과의 R. Keith Humphries 박사와 Simon Fraser University Animal Care Unit의 직원들에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Busulfex | 오츠카 캐나다 제약 Inc. | DIN 02240602 | 사용 직전에 멸균 PBS로 부설판을 3mg/mL로 희석합니다. Busulfan은 세포 독성이 있습니다. MSDS 및 기관 지침에 따라 취급 및 폐기하십시오. |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | 다른 용해 완충액으로 대체할 수 있지만 그에 따라 배양 시간을 조정해야 할 수도 있습니다 |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 |
참고문헌
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.).
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재인쇄 및 허가
