Summary

Framåt Genetics skärmar Använda makrofager att identifiera<em> Toxoplasma gondii</em> Gener Viktigt för Resistance till IFN-γ beroende cell autonoma immunitet

Published: March 12, 2015
doi:

Summary

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Abstract

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) är en obligat intracellulär, protozoer patogen. Det är den smittämnen av toxoplasmos, en hälsorisk med nedsatt immunförsvar. Det är också modellsystem för andra apicomplexan patogener som infekterar människor inklusive Cryptosporidium och Cyclospora. Toxoplasmos är oftast förvärvas genom intag av mat eller vatten förorenat med bradyzoite eller oocyst skede av parasiten. Vid förtäring, dessa stadier konvertera till tachyzoite stadiet av parasiten som replikerar i värdceller och sprider systemiskt. T-celler, IFN-γ och, i mindre utsträckning, kväveoxid 1-4, är viktiga för kontroll av infektion, men är inte i stånd att eliminera sjukdomen, som en andel av tachyzoiter konvertera till bradyzoite stadium som skyddas inom vävnadscystor vilket resulterar i en långlivad kronisk infektion. I själva verket finns det inga terapeutiska effektiva mot kronisk cysta stage av sjukdomen. Svår toxoplasmos är oftast på reaktivering av kvarstående infektion, med bradyzoite stadiet av parasiten konvertera tillbaka till snabbt repliker tachyzoite stadium karakteristisk för primär och akut infektion.

Tidigt överlevnad i ansiktet av det medfödda immunsvaret är viktigt att låta parasiten att nå tillräckligt parasitnummer, samt att nå distala platser, för att möjliggöra etablering av kronisk infektion. T. gondii har utvecklats strategier för att motverka värd försvarsmekanismer som sannolikt bidrar till dess förmåga att replikera och sprida tidigt infektion. Först, T. gondii bildar en unik PV under parasit invasion som är i stort sett åtskilda från endocytiska och exocytiska processer i värdcellen jämfört med andra intracellulära patogener 5-9. Också, liksom alla framgångsrika intracellulära patogener T. gondii modifierar sin värdcell för att skapa en tillåtande miljö feller tillväxt. Detta inkluderar omprogrammering värdcell genuttryck genom att förändra värdcellens transkriptionsfaktorer inklusive de viktiga för att reglera cellaktivering 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, GRA16 21 och GRA24 22 har alla visats vara viktigt för regleringen av transkriptionell respons och cellsignaleringskaskader av värdceller infekterade med T. gondii. Nya studier som använder genetiska korsningar mellan parasitstammar med olika fenotyper har varit mycket produktiv identifiera parasit gener som ligger bakom parasit genotyp beroende egenskaper inklusive försvårande av immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs) 16,19,23-26. Hos möss, immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs) är kritiska för kontroll av typ II och III genotyper av parasiten medan mycket virulent typ jag genotyper har utvecklats mekanismer för att kringgå murina IRGs. Men det är också klart att parasiten har utvecklat mekanismer för att undgå antimikrobiell mediertorer utöver de IRGs och att vissa av dessa mekanismer kan bevaras över parasit genotyper 27,28. Dessutom är mycket lite känt om de kritiska mediatorer av cell autonom immunitet mot T. gondii under mänsklig toxoplasmos. Parasit gener viktiga för resistens mot mediatorer för cell autonom immunitet kan också vara viktig för överlevnad under tachyzoite att bradyzoite konvertering som även kan utlösas av värdimmunsvar. Exempelvis kan kväveoxid vid höga nivåer trycka parasitreplikation i infekterade makrofager, men det kan också stimulera tachyzoite att bradyzoite omvandling resulterar i cysta produktion 30-32.

ToxoDB är en funktionell genomisk databas för T. gondii som fungerar som en kritisk resurs för området i fråga om att tillhandahålla sekvensinformation för parasiten genomet och tillgång till publicerade och opublicerade iska skala data inklusive samhällskommentarer, gen exp ression och proteomik uppgifter 33. Liknar många protozoiska patogener, majoriteten av genomet består av hypotetiska gener utan information som bygger på gen homologi att ge insikt i deras potentiella funktioner. Således är framåt genetik ett kraftfullt verktyg för att identifiera nya parasit gener som är viktiga för immun skatteflykt, cysta konvertering och andra funktioner som är kritiska för parasit patogenes samt för konvertering mellan olika utvecklingsstadier. En ytterligare styrka framåt genetik är att den kan användas som ett relativt icke-partisk syn att förhöra parasiten om de gener som är viktiga för specifika uppgifter i patogenes, inklusive immun skatteflykt och cystbildning. De senaste förbättringarna i nästa generations sekvense för mutations profilering har gjort det en metod för val för att identifiera de ansvariga parasit gener från terminskontrakt genetik studier med både kemiska och insertionsmutationer 34-37.

ntent "> Det är viktigt att identifiera sårbarheter i T. gondii som kan utnyttjas för att öka effektiviteten i cell autonoma immunmekanismer mot parasiten särskilt de som också kan vara verksamt mot resistenta cysta stadiet. Mot detta mål, ett in vitro murina makrofag infektion och aktivering modell utvecklades för att identifiera mutationer i parasit som specifikt försämra T. gondii kondition efter aktivering av infekterade makrofager men inte i naiva makrofager. Denna makrofag skärmen används för att förhöra ett bibliotek av T. gondii insättnings mutanter för att slutligen identifiera T. gondii-gener viktiga för resistens mot kväveoxid 27,28. Isoleringen av en panel av T. gondii-mutanter med försämrad beständighet mot aktivering av infekterade makrofager, i synnerhet en markant känslighet för kväveoxid, bevisade användbarheten av skärmen för att identifiera parasit gener viktiga för resistensmedlare av cell autonom immunitet annat än resistensmekanismer som beskrivs för de murina IRGs 28. Insertionsmutationer har fördelar jämfört kemiska mutagenes i termer av att generera ett begränsat antal slumpmässiga mutationer i varje parasit-klon och i teorin, enklare identifiering av platsen för mutationen. Emellertid identifiera den genomiska stället hos plasmid infogning i T. gondii insättnings mutanter, i praktiken, har varit överraskande svårt i många fall 37. Insättning av en plasmid i en gen är också sannolikt att störa funktionen av en gen i motsats till kemisk mutagenes som resulterar typiskt i enstaka nukleotidförändringar. Men kemisk mutagenes med antingen N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) kan erbjuda en ökad förmåga att analysera en större del av parasiten genomet, jämfört med insertionsmutationer, eftersom det skapar flera enstaka nukleotidpolymorfismer ( uppskattas till 10 -100) per mutant 34, 38. Dessutom har de senaste framstegen inom hela genomet profilering gjorde det möjligt att använda nästa generations sekvense att identifiera de mest sannolika kandidatgener som är ansvariga för den identifierade fenotypen av en muterad parasit 34,38. Oavsett vilken mutagenes tillvägagångssätt, bekräftelse av den roll av parasiten genen i resistens mot makrofagaktivering slutligen kräver gendeletion och komplemente att uppfylla molekylär Kochs postulat.

Förmågan att dissekera funktionen av en gen genom genetisk manipulering av både parasiten och makrofagen är viktigt eftersom många av de gener som identifierats via valuta genetik i T. gondii, samt andra patogener, kännetecknas fortfarande som hypotetiska gener med liten eller ingen sekvenshomologi till andra proteiner med kända funktioner. Den nuvarande pappers skisserar en allmän riktlinje som kan användas för att identifiera om den avbrutna genen i en mutant är viktigt för resistens mot en känd ellerokända förmedlare av cell autonom immunitet. Den inledande analysen av värdantimikrobiella faktorer utförs genom att utvärdera överlevnad vildtyp och muterade parasiter i makrofager från vildtypsmöss kontra de med specifika gen deletioner i inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS), gp-91 phox (NADPH-oxidas), och specifika immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs). Detta kommer att avgöra om de identifierade parasit gener är viktiga för resistens mot kväveoxid, reaktiva syremellan eller immunitetsrelaterade GTPaser 28 respektive eller om en okänd immunmekanism är involverad. Aktivering av infekterade makrofager med både IFN-γ och LPS, som beskrivs i det nuvarande protokollet, resulterar primärt i isolering av parasit gener som är viktiga för resistens mot kväveoxid 28. Användningen av farmakologiska medel som inducerar kväveoxid i frånvaro av makrofagaktivering (kväveoxiddonatorer) bekräftade att de flesta av de gener som identifierats var viktiga för remotståndskraften vid kväveoxid stället kväveoxid i samförstånd med ytterligare medlare i samband med makrofagaktivering 28.

Steg ett och två beskriver en framåt genetik skärm utformad för att isolera parasit mutanter med fitness defekt efter aktivering av infekterade benmärgsmakrofager in vitro. Steg ett beskriver en dostitrering analys för att empiriskt bestämma en dos av IFN γ och LPS att använda för makrofagaktivering som minskar parasiten replikering men hämmar inte replikering av vildtyp T. fullt gondii moderstammen som används för skapandet av bibliotek av parasit mutanter. Steg två beskriver den främre genetiska screeningen av de mutanta kloner i makrofager i 96-brunnsplattor. Steg tre skisserar en strategi för att bekräfta fenotypen av varje mutant identifierats i skärmen av de 96 brunnar och att utvärdera om felet i varje mutant påverkar parasit överlevnad, replikering,eller cysta produktion som svar på makrofagaktivering. Steg fyra beskriver användningen av benmärgshärledda makrofager från möss med deletioner i specifika antimikrobiella vägar för att identifiera de immunmediatorer till vilken parasiten mutanten är specifikt känsliga. Steg fem skisserar en strategi för att avgöra om en parasit mutant också äventyras för in vivo patogenes som utvärderats av cysta produktionen i hjärnan hos infekterade möss.

Protocol

OBS: Alla protokoll som innefattar användning av djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av New York Medical College Animal Care och användning kommittén. OBS: Detaljerad protokoll för kemisk mutagenes 38, isolering av parasiter genom att begränsa utspädning 38, isolering av murina benmärg härledda makrofager 39, tillväxten av T. gondii i mänsklig förhudsfibroblast (HFF) celler och cysta produktion i makrofager och grundläggande imm…

Representative Results

Toxoplasma gondii replikerar fritt i naiva makrofager och har en fördubbling tid mellan 6-12 h beroende på den stam av parasiten. Figur 1 visar representativa parasiter i naiva kontra aktiverade benmärgshärledda makrofager. Figur 2 visar den allmänna morfologin hos parasiter i HFF värdceller vid 2, 4, 8, 16 och 32 parasiter / PV. I det nuvarande protokollet, är parasiten tillåts invadera naiva makrofager och etablera en begynnande parasitofor vacuole (PV) före leverans…

Discussion

Den beskrivna protokollet ger en icke-partisk tillvägagångssätt som använder aktivering av murina benmärgsmakrofager och termins genetik att isolera T. gondii mutanter med en defekt i sin förmåga att överleva aktivering av infekterade makrofager. Fenotypen av mutanter efter makrofagaktivering faller vanligtvis in i två huvudkategorier: 1) Parasiterna verkar intakt men misslyckas med att replikera än 1 parasit per PV; 2) Parasiterna vara försämrade och kan vara i rymliga, amorfa PV. Det faktum att mu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

Materials

Name of the material Company Catalog number Comments
DMEM Hyclone SH3008101 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBS Thermo SH3091003 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBS Thermo SH3002802  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamine Thermo SH3003401  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strep Thermo SV30010  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSS Thermo SH3003002 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPS LIST biologicals 201 http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-g Pepro Tech Inc 50-813-664 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slides Thermo 177402 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical plates Thermo 165306 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture plates 353072 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25 156367 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehyde 18505 http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100 Fisher BP151 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 – protein conjugation kit Life Technologies A20181 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serum MP Biomedicals ICN19135680 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting media Vector Labs H1200 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTracker Life Technologies L-7526 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 mice Jackson Laboratories 664 http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out mice Jackson Labaoratories 2365 http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out mice Jackson Laboratories 2609 http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprusside ACROS Organics AC21164-0250  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOate ACROS Organics AC32865-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).
check_url/kr/52556?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

View Video