Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour générer de l'ingénierie tissulaire greffes de vaisseaux qui sont fonctionnels pour le greffage dans des souris en double ensemencement partiellement induite sur les cellules souches pluripotentes (IPFPC) – dérivé des cellules musculaires lisses et l'IPFPC – cellules endothéliales dérivées sur une décellularisée navire échafaudage bioréacteur.
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
La construction de conduits vasculaires est une stratégie fondamentale pour la réparation chirurgicale des vaisseaux endommagés et les blessés résultant de maladies cardiovasculaires. À ce jour, les matériaux utilisés dans la chirurgie de greffe comprennent les polymères synthétiques biocompatible (polytétrafluoroéthylène [Teflon], polytétrafluoroéthylène expansé [ePTFE; Gore-Tex] ou polyéthylène téréphtalate [Dacron]), allogreffes, tissus autologues (péricarde ou la veine saphène) et une xénogreffes. Alors que les greffes artificiels (par exemple, Gore-Tex et Dacron) sont les plus couramment utilisés, ces matériaux est susceptible de causer de nombreuses complications à court et à long terme qui incluent la sténose, le dépôt de calcium, thrombo-embolisation et les infections. Bien que les patients avec des greffes biologiques présents à une diminution des événements thrombo-emboliques, ils rencontrent encore des limitations comme échec de la greffe secondaire et la durabilité raccourcie en raison de la dégradation de la calcification 2. Par conséquent, malgré des améliorations significatives chirurgicale techniques au cours des années, les chercheurs et les cliniciens sont encore accablés par la nécessité d'identifier le conduit idéal pour les maladies vasculaires. Plus récemment, le domaine de l'ingénierie tissulaire vasculaire de recherche a généré un concept dans lequel les cellules sont incorporées dans des échafaudages biodégradables, avec le but de créer un environnement biomimétique qui incarne un navire fonctionnel pour une greffe réussie. Fondamentalement, le succès des constructions vasculaires dépendent de trois composantes essentielles; cellules qui comprennent l'échafaudage, ce est à dire, une couche interne de cellules endothéliales et une couche de cellules de muscle lisse, un échafaudage contenant la matrice extracellulaire approprié pour fournir des propriétés mécaniques comparables au système vasculaire d'origine, et la signalisation moléculaire / cellulaire qui est nécessaire pour initier / régulation réparation.
Longue perméabilité du greffon à long terme et le développement durable des néo-tissus sont fortement tributaires de l'ensemencement des cellules efficace des échafaudages, eereby rendu la décision du type d'une importance critique de la cellule. Plusieurs rapports démontrent l'utilisation de endothéliales matures et les cellules musculaires lisses de diverses sources pour développer conduits de petit diamètre 3-6. Bien que prometteuse, le manque de navires autologues suffisantes pour obtenir endothéliales matures et les cellules musculaires lisses restent un fardeau considérable. Plus récemment, les cellules souches provenant de diverses sources ont été exploitées pour des applications de génie tissulaire vasculaires. Cellules mononucléaires effet, les cellules souches pluripotentes une variété de types de cellules souches, y compris les cellules souches embryonnaires 7, induite (iPSCs) 8,9, Institut 10,11, dérivées de moelle osseuse 12, les cellules souches mésenchymateuses 13, les cellules progénitrices endothéliales et les parois des vaisseaux adultes -derived cellules souches antigène-1 (Sca-1) + cellules souches / progénitrices 14,15 ont tous été démontré être capable de différenciation en cellules endothéliales soit fonctionnel ou musculaires lisses en réponse à des milieux définis etconditions de culture. En outre, la capacité d'auto-renouvellement illimité des cellules souches rendre de meilleurs candidats contrairement endothéliales matures et les cellules musculaires lisses qui ne peut diviser un nombre fini de fois avant de subir arrestation et la sénescence croissance.
Le choix du matériel d'échafaudage puissent générer des tissus succès navire conçu pour la greffe dépend de plusieurs facteurs tels que la biocompatibilité, propriétés biomécaniques, et le taux de biodégradation. Fondamentalement, les matériaux utilisés pour créer des échafaudages pour les greffes devrait être biodégradable et ne seront pas monter réponses immunitaires bénéficiaires inutile. En outre, elle doit englober une porosité appropriée pour la fixation et de la microstructure et la survie cellulaire ultérieure. À ce jour, les matériaux les plus couramment utilisés pour les échafaudages en ingénierie tissulaire vasculaire comprennent les polymères d'acide glycolique, acide polylactique, et poly ε-caprolactone 16. Plus récemment, des matériaux biologiques ont décellulariséeségalement été appliquée avec un certain succès. Plusieurs laboratoires ont montré que l'ensemencement des navires porcine humaine décellularisée, canin ou avec des cellules autologues fourni une greffe biologique qui a résisté à la coagulation et l'hyperplasie intimale 17-19. Autres stratégies en génie tissulaire vasculaire comprennent extracellulaires greffes vasculaires base-protéines de la matrice par exemple des cellules d'ensemencement en gel de fibrine et 13 feuilles de cellules générant sans le soutien d'échafaudage 20, 21.
Le protocole actuel démontre la différenciation de l'Institut humaine dans l'endothélium fonctionnel et les cellules musculaires lisses, la génération d'un bioréacteur constitué d'un échafaudage de vaisseau décellularisé pour héberger des cellules vasculaires Institut dérivés fonctionnels, et le greffage des vaisseaux de l'ingénierie tissulaire en déficit immunitaire combiné sévère (SCID ) souris. IPFPC sont un type de cellule optimale à utiliser pour l'ingénierie tissulaire des greffes de vaisseaux parce que ces cellules ne forment pas de tumeurs chez la souris ou soulèvent éthique etréponses allo-immunes. En outre, nous avons montré que la stratégie pour générer des cellules musculaires pips-cellules endothéliales et les pépins-lisses est efficace et reproductible 10,11. Par la suite, nous avons conçu un vaisseau décellularisé pour l'ensemencement de cellules vasculaires dérivés de l'Institut pour imiter étroitement les protéines de la matrice qui existent au sein d'un vaisseau natif, améliorant ainsi l'efficacité de greffage et de survie. En outre, la décellularisation des vaisseaux avant IPFPC ensemencement empêche l'apparition de réactions inflammatoires montés par des types de cellules immunitaires telles que les macrophages. Plus important encore, ce protocole ne représente pas seulement une méthodologie pour générer promettant conduits vasculaires pour la traduction dans les humains, mais fournit également des moyens précieux d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la régénération des tissus vasculaires grâce à des modèles de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel indique un son, rapide, stratégie simple, efficace et reproductible dans lesquelles les navires de l'ingénierie tissulaire fonctionnels peuvent être générés en utilisant l'IPFPC à partir de fibroblastes humains. Cette technique représente un outil précieux pour la médecine régénérative, l'ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire potentiellement patient spécifique dans le proche avenir. Des mesures essentielles pour assurer l'efficacité du protocole comprennent …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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