Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali
Summary
This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.
Abstract
Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.
Introduction
Recenti studi hanno dimostrato che il riscaldamento transitoria associata con l'assorbimento di luce infrarossa da acqua (lunghezza d'onda> 1.400 nm) può essere utilizzato per indurre potenziali di azione nel tessuto nervoso 1 e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti 2. L'uso di luce infrarossa ha suscitato notevole interesse per applicazioni in protesi neurali, a causa della potenziale risoluzione spaziale più fine, di un contatto diretto con il tessuto, la minimizzazione degli artefatti di stimolazione, e la rimozione della necessità di modificare geneticamente le cellule prima della stimolazione ( come richiesto in optogenetics) 1. Nonostante tutti questi vantaggi, modelli termici recentemente sviluppati suggerito che i destinatari dei tessuti / cellule possono essere influenzati da effetti di riscaldamento cumulativi, quando più siti di stimolo e / o alti tassi di ripetizione sono utilizzati 3,4.
In risposta a queste sfide, i ricercatori hanno riconosciuto il potenziale di utilizzare absor estrinsecabri per la stimolazione del nervo a produrre effetti di riscaldamento più localizzati nel tessuto. Huang et al. Ha dimostrato questo principio usando nanoparticelle di ferrite superparamagnetiche per attivare da remoto i canali TRPV1 sensibili alla temperatura in HEK 293 cellule con una radio-frequenza di campo magnetico 5. Sebbene questa tecnica può consentire una penetrazione più profonda (campi magnetici relativamente interagiscono debolmente con tessuto), le risposte sono state registrate solo su periodi di secondi, piuttosto che le durate di millisecondi richiesti dispositivi bionici 5. Allo stesso modo, Farah et al. Stimolazione elettrica dimostrato di neuroni corticali di ratto con neri micro particelle in vitro. Hanno mostrato di precisione a livello di cella nella stimolazione con durate di impulso dell'ordine di centinaia di ms ed energie nella gamma di μJ, potenzialmente permette tassi di ripetizione più veloce 6.
L'uso di assorbitori estrinseci è stata applicata anche per indurrecambiamenti morfologici in vitro. Ciofani et al. Hanno evidenziato un aumento del ~ 40% nella crescita neuronale utilizzando piezoelettrici boro nitruro nanotubi eccitato da ultrasuoni 7. Analogamente, ferro endocitosi nanoparticelle di ossido in cellule PC12 sono stati riportati per migliorare la differenziazione dei neuriti in modo dose-dipendente, causa l'attivazione di molecole di adesione delle cellule con l'ossido di ferro 8.
Recentemente, l'interesse assorbitori estrinseci per assistere stimolazione neurale è anche concentrato sull'uso di nanoparticelle di oro (Au NP). Au NP hanno la capacità di assorbire efficacemente luce laser al picco plasmonica e dissiparlo nell'ambiente circostante nella forma di calore 9. Tra tutte le forme di particelle disponibili, l'assorbimento ottico di nanotubi d'oro (Au NR) corrisponde comodamente la finestra terapeutica di tessuti biologici (vicino infrarosso – NIR, lunghezza d'onda tra 750-1,400 nm) 10. Inoltre, nel context di stimolazione neurale, l'uso di Au NR offre biocompatibilità relativamente favorevole e una vasta gamma di opzioni di funzionalizzazione superficiale 11. Recenti studi hanno dimostrato che un effetto stimolante sulla differenziazione può essere indotta dopo esposizione laser continue di Au NR in NG108-15 cellule neuronali 12. Allo stesso modo, transienti intracellulari di calcio sono stati registrati in cellule neuronali coltivate con Au NRs dopo irradiazione laser modulato con frequenze variabili e lunghezze di impulso 13. Membrana cellulare depolarizzazione si è registrato anche dopo l'illuminazione laser NIR di Au NRs in colture primarie di neuroni gangliari spirale 14. La prima applicazione in vivo con irradiato Au NR è stata dimostrata solo di recente. EOM e collaboratori esposti Au NRs al loro picco plasmonica e hanno registrato un aumento di sei volte in ampiezza dei potenziali d'azione del nervo composto (CNaPS) e una diminuzione di tre volte nella soglia di stimolazione in ratti nervi sciatico. L'enrisposta ampliate è stato attribuito a effetti di riscaldamento locali derivanti dalla eccitazione del NR picco plasmonica 15.
Nel presente lavoro, vengono specificati protocolli per studiare gli effetti della stimolazione laser a NG108-15 cellule neuronali coltivate con Au NR. Questi metodi forniscono una semplice, ma potente, modo di irradiare popolazioni cellulari in vitro usando tecniche biologiche standard e materiali. Il protocollo si basa su un diodo laser accoppiato in fibra (LD) che permette un funzionamento sicuro e ripetibile allineamento. La preparazione del campione e laser metodi di irraggiamento Au NR possono essere ulteriormente estesi a diverse forme di particelle e colture cellulari neuronali, a condizione che si conoscono, rispettivamente, i protocolli di sintesi e di cultura specifica.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli descritti in questa presentazione descrivono come la cultura, differenziare e otticamente stimolare le cellule neuronali utilizzando assorbitori estrinseci. Le caratteristiche NR (ad esempio le dimensioni, la forma, risonanza plasmonica di lunghezza d'onda e chimica di superficie) ei parametri di stimolazione laser (come la lunghezza d'onda, la lunghezza di impulso, frequenza di ripetizione, ecc) possono essere variate per soddisfare diverse esigenze sperimentali. Gli effetti sul c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere NanoVentures Australia per sostegno finanziario di viaggio e il Prof. John Haycock per aver ospitato in parte questa ricerca presso l'Università di Sheffield e la signora Jaimee Mayne per il suo aiuto durante le riprese.
Materials
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Equipment name | Company | Catalogue Number | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre – coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
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