Oro nanorod asistida estimulación óptica de las células neuronales

Summary

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Abstract

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

Introduction

Estudios recientes han demostrado que el calentamiento transitorio asociado con la absorción de luz infrarroja por el agua (longitud de onda> 1400 nm) se puede utilizar para inducir potenciales de acción en el tejido nervioso ¹ y transitorios de calcio intracelular en cardiomiocitos ^2. El uso de luz infrarroja ha planteado un gran interés para aplicaciones en prótesis neurales, debido al potencial de resolución espacial más fina, la falta de contacto directo con el tejido, la reducción al mínimo de artefactos de estimulación, y la eliminación de la necesidad de modificar genéticamente las células antes de la estimulación ( como se requiere en la optogenética) ^1. A pesar de todos estos beneficios, modelos térmicos desarrollados recientemente sugirieron que los tejidos / células diana pueden verse afectados por efectos de calentamiento y acumulativos, cuando se utilizan múltiples sitios de estímulo y / o altas tasas de repetición ^3,4.

En respuesta a estos desafíos, los investigadores han reconocido el potencial de utilizar ABSOR extrínsecabros de la estimulación del nervio para producir efectos de calentamiento más localizadas en el tejido. Huang et al. Demostró este principio mediante el uso de nanopartículas de ferrita superparamagnéticas para activar remotamente los canales TRPV1 sensibles a la temperatura en las células HEK 293 con una radio-frecuencia del campo magnético ^5. Aunque esta técnica puede permitir una penetración más profunda (campos magnéticos interactúan relativamente débilmente con el tejido), las respuestas sólo se registraron durante períodos de segundos, en lugar de las duraciones de milisegundos requeridos en los dispositivos biónicos ^5. Del mismo modo, Farah et al. Estimulación eléctrica demostrada de neuronas corticales de rata con micro-partículas negras en vitro. Mostraron precisión a nivel celular en la estimulación utilizando duraciones de pulso del orden de cientos de microsegundo y energías en el rango de mu J, permitiendo potencialmente las tasas de repetición más rápidas ^6.

El uso de absorbentes de extrínsecos también se ha aplicado para inducircambios morfológicos in vitro. Ciofani et al. Mostraron un aumento de ~ 40% en el crecimiento externo celular neuronal utilizando piezoeléctricos nitruro de boro nanotubos excitados por ultrasonido ^7. Del mismo modo, se ha informado de nanopartículas de óxido de hierro endocitosis en las células PC12 para mejorar la diferenciación de neuritas en una manera dependiente de la dosis, debido a la activación de moléculas de adhesión celular con el óxido de hierro ^8.

Recientemente, el interés en absorbedores extrínsecos para ayudar a la estimulación neural también se ha centrado en el uso de nanopartículas de oro (Au NPs). Au NPs tienen la capacidad de absorber de manera eficiente la luz láser en el pico plasmónica y para disipar en el ambiente circundante en forma de calor ^9. Entre todas las formas de las partículas disponibles, la absorción óptica de nanorods oro (Au NRS) convenientemente coincide con la ventana terapéutica de tejidos biológicos (infrarrojo cercano – NIR, longitud de onda entre 750-1,400 nm) ^10. Además, en el context de estimulación neural, el uso de Au NR proporciona biocompatibilidad relativamente favorable y una amplia gama de opciones de funcionalización de la superficie ^11. Estudios recientes han demostrado que un efecto estimulador en la diferenciación puede ser inducida después de exposiciones láser continuo de Au NR en NG108-15 células neuronales ^12. Del mismo modo, los transitorios de calcio intracelulares se registraron en las células neuronales cultivadas con Au NR después de la irradiación láser modulada con frecuencias variables y longitudes de pulso ^13. Despolarización de la membrana celular también se registró después de NIR láser de iluminación de Au NR en cultivos primarios de neuronas del ganglio espiral ^14. La primera aplicación in vivo con irradiado Au NR se ha demostrado recientemente. Eom y compañeros de trabajo expuestos Au rupias en su pico plasmónica y registraron un aumento de seis veces en la amplitud de los potenciales de acción del nervio compuesto (CNaPS) y una disminución de tres veces en el umbral de estimulación en ratas nervios ciáticos. Los cuartosrespuesta hanced se atribuyó a los efectos de calentamiento locales que resultan de la excitación del pico plasmónica NR ^15.

En el presente trabajo, se especifican los protocolos para la investigación de los efectos de la estimulación con láser en NG108-15 células neuronales cultivadas con Au rupias. Estos métodos proporcionan una simple, pero potente, forma de irradiar poblaciones celulares in vitro utilizando técnicas y materiales biológicos estándar. El protocolo se basa en un diodo láser de fibra acoplada (LD) que permite un funcionamiento seguro y la alineación repetible. La preparación de la muestra y los métodos de irradiación láser Au NR se pueden ampliar a diferentes formas de partículas y cultivos de células neuronales, siempre que los protocolos de síntesis y cultura específicas son conocidas, respectivamente.

Protocol

1. Preparación Au rupias Nota: Au NR se puede sintetizar por una serie de recetas 16, o comprados de vendedores comerciales. Medir la densidad óptica inicial (OD) de la solución de Au NR través de espectroscopía de UV-Vis, mediante el registro de los valores de absorción de 300 nm a 1000 nm con una resolución de 0,5-2 nm. Variar el volumen de la solución a ser utilizado con la cubeta disponible. Evaluar la concentración molar inicial NP con una técni…

Representative Results

Mediante el uso de los Protocolos 1, 2 y 3 descritos aquí, se observó un efecto estimulador en la diferenciación en células NG108-15 neuronales cultivadas con Au NP (Au rupias, poli (estirenosulfonato) presenta el revestimiento Au rupias y revestido con sílice Au NR) después de láser exposiciones entre 1,25 y 7,5 W · cm de -2. Las imágenes confocales de marcado con rhodamineB Au NR demostraron que las partículas se interiorizaron de 1 día de incubación 12. La localización se observó p…

Discussion

Los protocolos descritos en esta presentación se describe cómo la cultura, diferenciar y ópticamente a estimular las células neuronales utilizando absorbentes extrínsecos. Las características NR (por ejemplo, dimensiones, forma, longitud de onda de resonancia de plasmón y química de la superficie) y los parámetros de estimulación láser (tales como longitud de onda, longitud de pulso, frecuencia de repetición, etc.) se pueden variar para que coincida con diferentes necesidades experimentales…

Materials

Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
FCS	Life Technologies	10100147
L-glutamine	Sigma Aldrich	G7513
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122
Amphotericin B	Life Technologies	15290018
Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775
Triton X-100	BDH	T8532
BSA	Sigma Aldrich	A2058
Anti-βIII-tubulin	Promega	G7121
TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody	Sigma Aldrich	T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
DMSO	Sigma Aldrich	472301
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
Equipment name	Company	Catalogue Number
UV-Vis spectrometer	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
Mini centrifuge	Eppendorf	Mini Spin
Sonic bath	Unisonics Australia	FPX 10D
Cell culture incubator	Kendro	Hera Cell 150
Cell culture centrifuge	Hettich	Rotofix 32A
Laser diode	Optotech	780 nm single mode fibre – coupled LD
Optical fiber	Thorlabs	780 HP
Power meter	Coherent	Laser Check
ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Epifluorescent microscope	Axon Instruments	ImageX-press 5000A
μ-slide well	Ibidi	80826
Inverted confocal microscope	Carl Zeiss Microscopy Ltd.	LSM 510 meta-confocal microscope
Oscilloscope	Tektronix	TDS210