Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
И транскрипции и пост-регуляция транскрипции имеют огромное влияние на экспрессию генов. Тем не менее, общепринятые на основе клеток методы скрининга сосредоточиться на регуляции транскрипции, являясь, по сути, направленные на выявление промотора таргетирования молекул. В результате, после транскрипции механизмы в основном раскрыты в экспрессии генов развития целевых лекарств. Здесь мы опишем клеточном анализе, направленную на изучение роли нетранслируемой области (3 '3 УТР) в модуляции судьбе своего мРНК, и в идентификации соединений, способных изменить его. Анализ основан на использовании люциферазы репортерного конструкта, содержащего 3 'UTR из интересующего гена стабильно интегрирован в болезнь релевантных клеточной линии. Протокол разделен на две части, с особым акцентом на первичном скрининге, направленной на идентификацию молекул, влияющих на активность люциферазы после 24 ч обработки. Вторая часть протоколаописывает против скрининга необходимо разделить соединения, модулирующие активность люциферазы в частности, путем УТР в 3 '. В дополнение к подробным протокола и репрезентативные результаты, мы обеспечиваем важных соображений о развитии анализа и проверки на попадание (ов) на эндогенной мишени. Описано на основе клеток репортер ген анализ позволит ученым идентифицировать молекулы, модулирующие уровни белка с помощью пост-транскрипционных механизмов, зависящих от 3 'UTR.
Introduction
В течение длительного периода транскрипции регуляции экспрессии генов считалось, играть существенным, если не исключительную роль в области контроля над производством белка. Накопленные данные, однако, показывает, что после транскрипции регулирование способствует столько же, если не более, регуляции транскрипции, чтобы определить клеточный белок обилие 1,2. Посттранскрипционных контроль экспрессии генов является гораздо более сложным и сложным, чем это было на первый взгляд. В самом деле, все различные этапы пост-контроля транскрипции появились, чтобы быть регламентированы, в том числе процессинга мРНК, локализации, оборота, перевод 3, а также недавно описанных обратимой РНК метилирования 4. Из числа посттранскрипционных регуляции процессов могут быть затронуты, анализа, описанного ниже фокусируется на тех, которые связаны 'нетранслируемой области (3' мРНК 3 UTR). 3 'UTR широко влияет мРНК судьбу в основном через специфического взаимодействия РНК-связывающего прoteins и некодирующие РНК к ее регуляторных последовательностей и / или вторичных структур 5. Таким образом, малые молекулы, которые изменяют эти взаимодействия или вмешиваться в верховьях передачи сигнала сместится баланс, который регулирует белковый изобилие. Этот терапевтический подход имеет особое значение для человека патологий, для которых существуют доказательства того, показывающие, что болезнь-актуальных гены подвергаются пост-транскрипционной регуляции, которая, таким образом, представляет собой потенциальную мишень для фармакологического вмешательства. Таким образом, системы, позволяющие для скрининга модуляторов уровни мРНК "путем вмешательства с посттранскрипционных механизмов управления в формате высокой пропускной могут стать ценным инструментом в идентификации возможных методов лечения романа.
Описанный на основе клеток ген-репортер анализ позволяет для идентификации соединений, способных модулировать мРНК судьбу с помощью механизмов, зависящих от ее 3'-UTR. Он состоит из нескольких главная Сomponents (рисунок 1) и требует несколько предварительных шагов для проверки возможности анализа. Прежде всего, репортер конструкция предназначена для включения UTR 3'от интересующего гена. 3 'UTR слит с конца гена-репортера, например, люциферазы светлячка (фиг.1). Любые изменения в пост-транскрипционных механизмов контроля, осуществляемого с помощью вставленной 3 'UTR изменит стабильность и / или эффективность трансляции этого химерного транскрипта, что приводит к различным уровням люциферазы. Таким образом, изменения в активности люциферазы служить косвенной мерой пораженной после регуляции транскрипции интересующего гена. Второй компонент системы является контроль репортерной конструкцией, идентичной плазмида экспрессии, который выражает тот же ген-репортер, но не содержит каких-либо 3 'UTR. Два репортер плазмиды могут быть разработаны в лаборатории с использованием обычных протоколов молекулярной биологии и приобрести у коммерческих источников.
Выбор соответствующей клеточной линии является критическим для строительства анализа. Какие клеточная линия оптимальная модель зависит от многих факторов, начиная от клинических потребностей, таких как максимальное сходство с патологией просто практических вопросов, таких как характеристики доступности, transfectability и роста. Важно отметить, что до продолжения необходимо убедиться, что слияние 3 'UTR, чтобы гена-репортера имеет ожидаемый эффект на уровне химерного транскрипта. Отсутствие существенных различий в люциферазы сигнал от 3 'UTR-подшипника и управления репортера конструкций временно трансфицировали в выбранных клетках будет означать, что 3' UTR не работает в этой клеточной модели, запроса на поиск альтернативных единиц. Для формата высокой пропускной, 3'-UTR-подшипников и контроль конструкции репортера люциферазы должно быть стабильно интегрирована в выбранной клеточной линии. Использование стабильно интегрировать по трансфицированыклеточная линия, предпочтительно по нескольким причинам. Это позволит расширить выбор сотовой модели, включая труднодоступных трансфекции клеточных линий, уменьшить изменчивость в данных, возникающих в результате колебаний эффективности трансфекции, стихают затраты. Кроме того, при временной трансфекции клеток очень часто перегружена плазмиды ДНК, ведущем к насыщению системы. В этих условиях дальнейшее увеличение экспрессии репортера может быть сложным, что приводит к снижению чувствительности к потенциальным соединений повышающей регуляции.
Наконец, когда все компоненты пробы, установлены, очень важно, прежде чем перейти к формату высокой пропускной определить целесообразность анализа, то есть, если активность люциферазы может быть действительно вверх и вниз регулируется частности, с помощью вставляется 3 ' УТР. Лучшие контроль будет малые молекулы, представленные модулировать стабильность или возможности перевода мРНК с помощью UTR 3'интерес. Если наличие нихневозможно, суррогатные управления, имитирующие желаемого эффекта не принимаются. Это могут быть микроРНК или РНК-связывающие белки, известные проявляют свое действие посредством связывания с 3 'UTR интереса. Оценка таких элементов управления, прежде чем первичный скрининг показывает не только функциональные возможности разработанного теста, а также позволяет для оценки его динамический диапазон, чувствительность и производительность в формате высокой пропускной способности.
Использование описанного протокола мы провели скрининг в 2000-библиотеки соединений 6. Нейробластома, наиболее распространенным экстракраниальных твердое опухоль младенчестве, был использован в качестве биологической модели и 3 'UTR онкогена MYCN, чьи амплификации сильно предсказывает неблагоприятный исход из нейробластомы, как гена-мишени 7. Рисунок 2 описывает экспериментальную схему. Скрининг был разделен на три трассы с размером партии 27 пластин, обследованных на один проход. Партия 27 пластин включены библиотеки набора спектраПлиты n.1-n.8 + n.25 (первый запуск), N.9-n.16 + n.25 (второй заход) и n.16-n.24 + n.25 (третий ход), каждый плита показан в трех экземплярах. Таким образом, одна библиотека пластина (n.25) анализировали во всех трех прогонов делает возможным сравнение между перспективе. Протокол ниже описывает один проход 9 библиотеки пластин, испытанных в трех экземплярах.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
