高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
转录和转录后调控对基因表达产生深远的影响。然而，普遍采用的基于细胞的筛选试验集中于转录调控，而实质上旨在启动子靶向分子的鉴定。其结果是，转录后机制在很大程度上未覆盖由基因表达的靶向药物的开发。在这里，我们描述了，并在确定能够修改它的化合物旨在调查的3'非翻译区（3'非编码区），在其mRNA的命运的调制的作用的基于细胞的测定。该测定法是基于使用含有感兴趣的基因稳定地整合入一个疾病相关的细胞系的3'非编码区一个萤光素酶报道构建体。该协议被分成两部分，与最初的焦点上的初级筛选旨在治疗24小时后影响萤光素酶活性的分子的鉴定。该协议的第二部分介绍了反筛选必要区分化合物特别是通过3'UTR调控荧光素酶的活性。除了详细协议和有代表性的结果，我们提供关于该测定的开发和上内源靶的命中（多个）的验证重要的考虑因素。所描述的基于细胞的报告基因分析将帮助科学家识别分子通过依赖于3'UTR转录后调节机制蛋白质水平。
Introduction
对于基因表达的很长一段转录调控被认为发挥了重大的，如果在控制蛋白质的生产不是唯一的作用。越来越多的证据，但是，表明转录后调控贡献之多，如果不超过，转录调控，以确定细胞蛋白质丰度1,2。基因表达的转录后调控更加复杂和精细的比起初的想法。事实上，转录后调控的所有各个阶段都出现了调控，包括mRNA加工，本地化，营业额，翻译3以及新描述的可逆RNA甲基化4。从一些转录后调控过程可能受到影响，测定下面描述着重于那些涉及mRNA的3'非翻译区（3'非编码区）。 3'UTR广泛影响mRNA的命运通过特定的RNA结合公关互动为主oteins和非编码RNA，以它的调节序列和/或二级结构5。因此，小分子改变这些相互作用或干扰的上游信号转导途径将转向，调节蛋白质丰度的平衡。这种治疗方法是用于人类疾病的量存在证据表明疾病相关基因进行转录后调节，从而代表了药物干预的潜在目标特别重要的。因此，系统通过用在高通量形式的转录后控制机制的干扰，允许mRNA水平“调节剂的筛选可成为潜在的新的治疗方法的鉴定有价值的工具。
所描述的基于细胞的报道基因测定允许对能够经由依赖于它的3'端非编码区的机制来调节的mRNA命运的化合物的鉴定。它由几个主要的Components（ 图1），并且需要几个预备步骤来验证该测定的可行性。首先，所述报道构建体被设计为包括3'从感兴趣的基因的UTR。的3'端非编码区融合到报道基因的末端，如萤火虫荧光素酶（ 图1）。通过插入的3'端非编码区施加的任何变化在转录后控制机制将改变该嵌合转录物的稳定性和/或翻译效率，从而导致不同的荧光素酶的水平。因此，改变荧光素酶活性的服务感兴趣的基因的受影响的转录后调控的间接测量。该系统的第二组分是控制报道构建，表达相同的报道基因，但不包含任何3'非编码区相同的表达质粒。两个报告质粒可以设计在实验室使用常规的分子生物学的协议或从商业来源购买。
合适的细胞系的选择是用于测定施工的关键。其中细胞系是最佳的模式取决于很多因素，包括从像最大的相似之处病理像可用性，transfectability和生长特性只是实际问题的临床需求。重要的是，前，继续进行1应该确保融合的3'端非编码区的报道基因对嵌合转录物的水平的预期效果。没有来自3中的荧光素酶信号显著差异的'UTR轴承和对照报道构建体瞬时转染在所选择的细胞将指示该3'端非编码区是未官能此细胞模型中，提示输入搜索替代的。对于高通量格式中，3'端非编码区，轴承和控制荧光素酶报道构建体应当稳定地整合在所选择的细胞系。使用稳定整合在瞬时转染细胞系是优选的有几个原因。这将扩大的蜂窝模型，包括难以转染的细胞系的选择，降低在从转染效率的波动所产生的数据的可变性，消退的费用。此外，当瞬时转染的细胞经常超负荷的DNA质粒导致系统的饱和度。在这些设置在记者表达的进一步增加可能是具有挑战性的，导致对潜在的上调化合物的灵敏度下降。
最后，当所有试验组分均成立，它是移动到高通量形式，以确定该测定， 即可行性前关键的，如果荧光素酶活性可以确实上调和下调经由插入3'特异性UTR。最好控制将是报道通过感兴趣的3'非编码区来调节mRNA的稳定性或译小分子。如果有这些是不可能的，替代的控制模仿所希望的效果被接受。这些可以是miRNA的或已知通过结合感兴趣的3'端非编码区，以发挥它们的作用的RNA结合蛋白。评价这种控制前的初级筛选不仅表示显影测定法的功能，而且还允许估计在高通量形式的动态范围，灵敏度和性能。
使用所描述的协议，我们筛选了2000化合物库6。神经母细胞瘤，婴儿期最常见的颅外实体肿瘤，被用作生物模型和MYCN癌基因，其扩增的3'端非编码区强烈预示神经母细胞瘤的不良结果，作为目标基因7。 图2列出了实验布局。筛选被分为三个运行与27板筛选一次运行该批处理大小。本批27片包括光谱采集库板N.1-N.8 + n.25（第一轮），N.9，n.16 + n.25（第二轮），并n.16，n.24 + n.25（第三轮），每个板筛选一式三份。因此，一个库板（n.25）所有三种运行使得可能相互比较的运行范围内测定。以下协议描述了一个单，一式三份测试9库板运行。
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
