후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
전사와 전사 후 조절은 모두 유전자 발현에 지대한 영향을 미친다. 그러나, 일반적으로 채택 세포 기반 스크리닝 분석은 본질적으로 프로모터 대상 분자의 식별을 목표로하고, 전사 조절에 초점을 맞 춥니 다. 그 결과, 전사 후 기전은 주로 유전자 발현 표적 약물 개발에 의해 발견된다. 여기에서 우리는 그것을 수정할 수 화합물을 식별하는 자사의 mRNA의 운명의 변조의 3 '번역 영역 (3'UTR)의 역할을 조사하기위한 셀 기반 분석을 설명합니다. 분석은 안정 질병 관련 세포주에 통합 관심 유전자의 3 'UTR을 포함하는 루시퍼 라제 리포터 구조물의 사용에 기초한다. 프로토콜은 치료 후 24 시간 후 루시퍼 라제 활성에 영향을 미치는 분자 식별 목적 일차 스크리닝에서 초기 포커스로, 두 부분으로 분할된다. 프로토콜의 두 번째 부분설명 카운터 선별 특히 3 'UTR을 통해 루시퍼 라제 활성을 조절 화합물을 구별 할 필요가있다. 프로토콜 상세 및 대표적인 결과 외에, 우리는 분석법 개발 및 내인성 표적에 적중 (들)의 유효성에 대한 중요한 고려 사항을 제공한다. 셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법 과학자 3 'UTR에 종속 전사 후 기전을 통해 단백질 수준을 조절 분자를 식별 할 수 있도록 할 것이다.
Introduction
유전자 발현의 장기간 전사 조절에 단백질 생산을 조절 배타적이지 않은 경우 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각 하였다. 축적 된 증거 그러나, 전사 후 조절은 세포 단백질 풍부 1,2-를 결정하는만큼, 그렇지 않은 경우, 전사 조절 이상 기여 것을 나타낸다. 유전자 발현의 전사 후 제어는 제 생각에보다 훨씬 더 복잡하고 정교하다. 사실, 전사 후 제어 모든 다양한 단계는 mRNA의 프로세싱, 지역화, 회전율, 번역 3뿐만 아니라 새롭게 기재된 가역적 RNA 메틸화 4 포함한 조절되는 것으로 나왔다. 전사 후 조절 프로세스의 개수가 영향을받을 가능성에서, 분석은 후술 mRNA의 3 '비 번역 영역 (3'UTR)을 포함하는 것들에 집중한다. 3 'UTR는 크게 RNA 결합 홍보의 특정 상호 작용을 통해 주로 mRNA의 운명에 영향을 미칩니다규제 시퀀스 및 / 또는 보조 구조 5 oteins 및 비 코딩 RNA를. 따라서, 이러한 상호 작용을 변경하거나 업스트림 신호 전달 경로를 방해 소분자 단백질 존재 량을 조절하는 밸런스를 이동한다. 이 치료 방법은있는 증거가 질병 관련 유전자를 따라서 약물 학적 개입의 대상이 될 가능성을 나타내는 전사 후 조절,을 실시한다 보여주는 존재하는 인간의 병리 특히 중요하다. 따라서, 높은 처리량 형식의 전사 후 조절 기전과의 간섭을 통해 mRNA 수준 '조절제의 스크리닝을 가능 시스템은 잠재적 인 신규 한 치료의 확인에 유용한 도구가 될 수있다.
셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법은 3 'UTR에 의존 기전을 통해 mRNA의 운명을 조절 할 화합물의 식별을 허용한다. 그것은 몇 가지 주요한 C로 구성omponents (그림 1)과 몇 가지 예비 단계를 필요는 분석의 타당성을 검증합니다. 우선, 리포터 구조물은 관심 유전자의 3 'UTR을 포함하도록 설계된다. 3 'UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (도 1)와 같은 리포터 유전자의 말단에 융합된다. 삽입 된 3 'UTR을 발휘 전사 후 조절 메커니즘의 변경은 다양한 루시 페라 수준의 결과,이 키메라 성적 증명서의 안정성 및 / 또는 번역 효율을 변경합니다. 따라서, 루시 페라 제 활동의 변화는 관심의 유전자의 영향을받는 전사 후 조절의 간접 측정을 제공합니다. 시스템의 제 2 성분 제어 리포터 구조체 같은 리포터 유전자를 발현하지만 임의 3 'UTR을 포함하지 않는 동일한 발현 플라스미드이다. 두 개의 리포터 플라스미드는 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 실험실에서 설계 또는 시판 처로부터 구입할 수있다.
적절한 세포주의 선택은 구조 분석에 중요하다. 어떤 세포주가 최적의 모델입니다 가용성, transfectability, 성장 특성 같은 단지 실제적인 문제에 대한 병리 최대 유사 같은 임상 적 요구 사항에 이르기까지 수많은 요인에 따라 달라집니다. 중요한 것은, 이전에 하나의 리포터 유전자 3 'UTR의 융합 키메라 성적의 수준에 예상되는 효과가 있는지 확인해야합니다 진행합니다. 3에서 루시 페라 제 신호에 유의 한 차이가 없으면 다른 사람의 검색하라는 메시지 UTR이 세포 모델에서 작동하지 않습니다 'UTR 베어링 및 제어 기자가 일시적으로 (3)가 있음을 나타냅니다 선택한 셀에 형질 구축'. 고 스루풋 포맷의 경우, 3 'UTR 베어링 및 제어 루시퍼 라제 리포터 구조물을 안정적으로 선택된 세포주에 통합되어야한다. 사용하여 안정적으로 일시적를 통해 통합 된 형질 전환세포계는 여러 가지 이유로 바람직하다. 이것은 비용을 가시고, 형질 전환 효율의 변동으로부터 발생하는 데이터의 변동을 감소 어려운 트랜 세포주를 포함한 셀룰러 모델의 선택 범위를 확장 할 것이다. 또한, 일시적인 형질 세포에 매우 자주 시스템의 포화에 이르는 DNA 플라스미드 오버로드됩니다. 이러한 설정에서 기자 발현의 추가 증가는 잠재적 인 상승 조절 화합물으로 감소 감도의 결과, 문제가 될 수 있습니다.
모든 분석 성분을 설정할 때 루시퍼 라제 활성이 참으로 상향 및 하향 조절 3 '삽입을 통해 구체적으로 될 수있는 경우 마지막으로, 그것은 분석, 즉의 타당성을 결정하기 위해 고 스루풋 포맷으로 이동하기 전에 중요 UTR. 가장 관심 컨트롤 3 'UTR을 통해 mRNA의 안정성 또는 번역 능력을 조절하는 것으로보고 소분자 것이다. 이러한를 갖는 경우가능하지, 원하는 효과를 모방 대리 컨트롤이 허용됩니다. 이러한 miRNA가 또는 관심의 3 'UTR에 결합을 통해 그 효과를 발휘하는 것으로 알려져 RNA 결합 단백질이 될 수 있습니다. 이러한 제어 평가 일차 스크리닝 분석법 개발의 기능을 나타내고, 또한 높은 스루풋 포맷의 동적 범위, 감도 및 성능 추정을 허용하지 전에 만.
설명 프로토콜을 사용하여 우리는 2,000 화합물 라이브러리 (6) 상영. 신경 모세포종, 유아기의 가장 흔한 두개 외 고형 종양은 생물학적 모델로서 사용하고, 증폭 MYCN 종양 유전자의 3 'UTR 강하게 표적 유전자는 7 아세포종의 불리한 결과를 예측한다. (2) 실험 레이아웃을 설명도. 심사는 하나의 실행에서 상영 27 판의 배치 크기로 3 실점으로 분할되었다. 27 판의 배치는 스펙트럼 컬렉션 라이브러리를 포함플레이트 N.1 – n.8 + n.25 (첫 번째 실행), n.9-n.16 + n.25 (두 번째 실행)과 n.16 – n.24 + n.25 (제 3 군), 각 판은 세중에서 상영. 따라서, 하나의 라이브러리 판 (n.25)이 가능한 간 실행 비교를 세 가지 실행 내에서 측정 하였다. 이 프로토콜은 아래 중으로 시험 9 라이브러리 판의 단일 실행에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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