Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши
Summary
Новый экс естественных условиях подготовки к визуализации мыши спинного мозга. Этот протокол позволяет двухфотонного изображений живых клеточных взаимодействий в течение спинного мозга.
Abstract
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
Introduction
Мышиные модели демиелинизации, в том числе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭОС) и внутричерепной инфекции вирусом neuroadapted мыши гепатит (MHV), являются отличными инструментами для изучения молекулярных путей и клеточные взаимодействия, связанные с болезнью. Они привели к и поддерживается эффективность FDA одобрило фармацевтических методов лечения, в основном, для прекращения аутоиммунных и воспалительных 1. Однако, как только эндогенного ремиелинизация не удалось, утвержденные в настоящее время терапия не могут эффективно ремонтировать демиелинизированные поражений в центральной нервной системе. Таким образом, ремонт ориентированных методов лечения на этой стадии заболевания имеют решающее значение для облегчения хронических симптомов и улучшения качества жизни. В последнее время нейронные клетки-предшественники (НПК) пришли на первый план в качестве потенциального регенеративного метода лечения на проблемные участки воспаления и демиелинизации. Несколько исследований выявили способность NPC, чтобы вызвать endogenoнам ремиелинизации и непосредственно участвовать в ремиелинизации 2-8. Потому что НПС участвуют в непосредственном ремиелинизации, необходимо, чтобы понять их кинетики и взаимодействия с эндогенными клеток после трансплантации. После трансплантации НПС мигрируют вентрально в районы белого повреждений материи, то рострально и каудально по отношению к месту пересадки 5,9. Кинетика миграции отличаются в ответ на сигналы окружающей среды; НПС пересаженные в неповрежденных спинного мозга имеют больше скорости, чем NPC, пересаженных в поврежденный спинной мозг 6. После миграционный период, переданы НПС размножаться широко, по более высокой ставке в поврежденном спинном мозге по сравнению с интактной спинного мозга 6. И, наконец, большинство НПС дифференцироваться в олигодендроциты и инициировать прямой ремиелинизацию 4,6,9.
Демиелинизированные поражение является сложным и может включать в себя разнообразную популяцию клеток на различных стадияхctivation. Например, активный рассеянный склероз (MS), поражение может включать значительное население активированных Т-клеток микроглии, M1 и M1 макрофагов, а хроническое повреждение молчание МС может состоять в основном из реактивных астроцитов с несколько воспалительных клеток 10-13. Из-за разнообразия эффекторных клеток, два фотона (2P) изображений в мышиных моделях демиелинизации является чрезвычайно полезным инструментом, чтобы помочь понять местные клеточные взаимодействия внутри поражения. В MS и многих широко используемых моделей MS-исследовательских, большинство поражений расположены на брюшной стороне спинного мозга, области недоступны для визуализации прижизненный 2P-за глубины поражения и высоким содержанием липидов в спинном мозге. Чтобы обойти эти проблемы и исследование межклеточных взаимодействий в рамках поражений вдоль вентральной спинного мозга мы разработали простой экс естественных 2P подготовки изображений 6.
Это исследование является продолжением предыдущей публикации методы, которые показалиПроцедура пересадки усиленный зеленый флуоресцирующий белок (EGFP), экспрессирующие НПС в спинном мозге мышей после JHMV штамма MHV-индуцированной демиелинизации 14. Пять недельных мышей, инфицированных JHMV и пересадить с EGFP-NPC, на грудном уровне 9 на 14 день после заражения. Протокол, представленные здесь приведены подробные шаги на том, как извлечь спинной мозг, сделать Экс Vivo агарозном подготовку и изображения пересадить EGFP-NPC взаимодействия с повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) экспрессирующие аксонов. Мыши, экспрессирующие EYFP под нейронов конкретных Thy1 промотора были использованы в этой процедуре 15. Только некоторые из аксонов выразить EYFP, что делает его полезным для работы с изображениями отдельных аксонов. Здесь мы показываем, спинного мозга удалены через 7 дней после трансплантации; Однако, спинной мозг может быть извлечена в любой момент времени после трансплантации. В то время как показано взаимодействие НПС с поврежденных аксонов, наш протокол может быть использован в сочетании с генетическими флуоресцентных маркеровдругих типов клеток, чтобы исследовать множество клеточных взаимодействий, происходящих во всем спинного мозга мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
В режиме реального времени 2P визуализации неповрежденной ткани, необходимых для расследования NPC кинетики и взаимодействий при трансплантации в демиелинизированные мыши спинного мозга. Изображения прижизненные 2P обычно используется для определения клеточной динамики на спинной ст?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
- Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
- Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
- Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
- Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
- Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
- Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).
- McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
- Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
- Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
- Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).
