التقييم الوظيفي والمورفولوجية من الحجاب الحاجز تعصيب من قبل الحجابي موتور الخلايا العصبية
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
التصلب الضموري العضلي الجانبي (ALS) هو مرض العصبون الحركي الموهنة المرتبطة مع فقدان كل من الخلايا العصبية الحركية العليا والسفلى وشلل العضلات يترتب على ذلك. على التشخيص، وبقاء المريض على متوسط سنوات فقط 1 5/2. الحجابي الخلايا العصبية الحركية (PhMN) الخسارة هي عنصر حاسم في التسبب في المرض. المرضى يموتون في النهاية بسبب فقدان PhMN تعصيب من الحجاب الحاجز، وعضلات الأولية للإلهام 2،3. إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هي أيضا مشكلة خطيرة مع صعوبات في التنفس المرتبطة بها. ما يقرب من 12،000 حالة جديدة من حالات اصابات النخاع الشوكي تحدث كل 4 سنوات وذلك بسبب الأضرار الصدمة إلى الحبل الشوكي. على الرغم من عدم التجانس مرض فيما يتعلق الموقع، نوع وشدة، والغالبية العظمى من الحالات SCI تنطوي على الصدمة إلى الحبل الشوكي العنقي، الذي غالبا ما يؤدي إلى حل وسط التنفسي المنهكة ومستمرة. بالإضافة إلى ALS واصابات النخاع الشوكي، وغيرها من الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض يمكن أن تكون مرتبطة ثإيث ضعف الجهاز التنفسي البطني 5،6.
العصب الحجابي هو العصب المحرك ناقل أن يعصب المماثل نصفي الحجاب الحاجز والتي تنبع من أجسام الخلايا PhMN تقع في مستويات C3-C5 من الحبل الشوكي العنقي المماثل. يتم التحكم الانتاج PhMN التي كتبها تنازلي إدخال البصلي النخاعي من الدماغ في منطقة تعرف باسم مجموعة منقاري بطني الجهاز التنفسي (rVRG) 7. الدائرة rVRG-PhMN-غشاء أساسية لمراقبة التنفس الشهيق، فضلا عن غيرها من السلوكيات الحجاب الحاجز غير التهوية. مختلف الإصابات والاضطرابات العصبية التي تؤثر على هذه الدوائر يمكن أن يؤدي إلى انخفاض شديد في وظيفة الجهاز التنفسي ونوعية حياة المريض. تنازلي مساهمة في PhMNs من البقاء على قيد الحياة rVRG، PhMN وسلامة العصب الحجابي وتعصيب السليم عند تقاطع الحجاب الحاجز العصبي العضلي (NMJ) هي كل ما يلزم من أجل وظيفة الحجاب الحاجز العادية. ولذلك فمن المهم أن توظف التقنيات التييمكن تقييم كمي هذه الدائرة في الجسم الحي في نماذج القوارض من ALS، SCI وأمراض الجهاز العصبي المركزي أخرى.
مع هذا البروتوكول، والهدف هو وصف الأدوات التجريبية لتقييم PhMN تعصيب من الحجاب الحاجز في كل من الكهربية ومستويات شكلية. وتسجل إمكانات عمل العضلات مجمع (CMAPs) من خلال تحفيز جميع محاور الخلايا العصبية الحركية صادر من العصب المحرك معينة ثم تحليل استجابة الاستقطاب انتزع من myofibers الهدف. هذه التقنية يمكن استخدامها في الجسم الحي في الفئران تخدير والفئران لتحديد تعصيب وظيفي من نصفي الحجاب الحاجز بواسطة PhMNs 8. يرجع ذلك إلى حقيقة أن CMAPs تمثل التسجيل المتزامن لجميع (أو على الأقل الكثير / معظم) myofibers للمجلس بكامل هيئته نصفي الحجاب الحاجز، فمن المفيد أيضا بدراسة الظواهر من المحاور الحركية الفردية وmyofibers في NMJ الحجاب الحاجز من أجل تتبع المرض – والعلاج المناسب تغيرات شكلية مثل جزئية ومجمعاتالشركة المصرية للاتصالات إزالة التعصيب، تنتشر على التجدد وعودة التعصيب. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق كله جبل المناعية (IHC) من الحجاب الحاجز، يليها تقييم الصرفي مفصل للل NMJs الفردية في جميع أنحاء العضلات 9. الجمع بين CMAPs ويقدم تحليلا NMJ طريقة فعالة لدراسة كميا تعصيب البطني في نماذج القوارض من أمراض الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما تم تسوية وظيفة الجهاز التنفسي في كل من الصدمة SCI وALS وتطوير العلاجات التي تستهدف التنفس وتحديدا تعصيب الحجاب الحاجز هي ذات الصلة سريريا 5،6. من أجل دراسة شاملة وظيفة الجهاز التنفسي، يجب استخدام أسلوب نهج موحد. CMAPs قياس درجة تعصيب وظيفي من الحجاب الحاجز عن طريق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
