मध्यच्छद मोटर न्यूरॉन्स द्वारा डायाफ्राम INNERVATION के कार्यात्मक और morphological आकलन
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस) के ऊपरी और निचले मोटर न्यूरॉन्स और फलस्वरूप मांसपेशी पक्षाघात दोनों की हानि के साथ जुड़े एक दुर्बल करने वाली मोटर न्यूरॉन बीमारी है। निदान पर, मरीज अस्तित्व औसत केवल 2-5 साल 1 पर है। मध्यच्छद मोटर न्यूरॉन (PhMN) हानि ए एल एस के रोगजनन का एक महत्वपूर्ण घटक है। मरीजों को अंततः कारण डायाफ्राम की PhMN विन्यास, प्रेरणा 2,3 के प्राथमिक पेशी के नुकसान के लिए मर जाते हैं। घाव रीढ़ की हड्डी में चोट (एससीआई) ने भी जुड़े साँस लेने में कठिनाई के साथ एक गंभीर समस्या है। एससीआई के लगभग 12,000 नए मामले की वजह से रीढ़ की हड्डी के लिए दर्दनाक क्षति के लिए हर साल 4 से होते हैं। स्थान, प्रकार और गंभीरता के संबंध में रोग विविधता के बावजूद, एससीआई मामलों के बहुमत अक्सर दुर्बल और लगातार सांस समझौता में जो परिणाम ग्रीवा रीढ़ की हड्डी, को आघात शामिल है। ए एल एस और एससीआई के अलावा, अन्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगों डब्ल्यू संबद्ध किया जा सकताith मध्यपटीय सांस की शिथिलता 5,6।
मध्यच्छद तंत्रिका ipsilateral हेमी-डायाफ्राम innervates कि एक अपवाही मोटर तंत्रिका है और कहा कि ipsilateral ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की सी 3-सी 5 के स्तर में स्थित PhMN सेल शरीर से निकलती है। PhMN उत्पादन व्याख्यान चबूतरे उदर सांस समूह (rVRG) 7 के रूप में जाना एक क्षेत्र में brainstem से bulbospinal इनपुट उतरते द्वारा नियंत्रित किया जाता है। rVRG-PhMN-डायाफ्राम सर्किट नि: श्वसन साँस लेने की है, साथ ही अन्य गैर-जीवन रक्षक प्रणाली डायाफ्राम व्यवहार के नियंत्रण के लिए केंद्रीय है। इस circuitry के प्रभावित करने वाले विभिन्न दर्दनाक चोटों और neurodegenerative विकारों श्वसन समारोह और जीवन के मरीज की गुणवत्ता में एक गहरा गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। डायाफ्राम neuromuscular जंक्शन (NMJ) में rVRG, PhMN अस्तित्व, मध्यच्छद तंत्रिका अखंडता और उचित विन्यास से PhMNs के लिए इनपुट उतरते सामान्य डायाफ्राम समारोह के लिए सभी आवश्यक हैं। यह तकनीक काम करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है किमात्रात्मक ए एल एस, एससीआई और अन्य सीएनएस रोगों के कृंतक मॉडल में vivo में इस सर्किट का मूल्यांकन कर सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल के साथ, लक्ष्य electrophysiological और रूपात्मक दोनों स्तरों पर डायाफ्राम की PhMN विन्यास का आकलन करने के लिए प्रायोगिक उपकरणों का वर्णन करने के लिए है। यौगिक मांसपेशियों कार्रवाई क्षमता (CMAPs) एक दिया मोटर तंत्रिका के सभी अपवाही मोटर न्यूरॉन एक्सोन उत्तेजक और फिर लक्ष्य myofibers का हासिल विध्रुवण प्रतिक्रिया का विश्लेषण करके दर्ज कर रहे हैं। इस तकनीक PhMNs 8 से हेमी-डायाफ्राम के कार्यात्मक स्फूर्तिदान यों के लिए anesthetized चूहों और चूहों में vivo में इस्तेमाल किया जा सकता है। कारण CMAPs हेमी-डायाफ्राम पूरे, यह भी बीमारी को ट्रैक करने के क्रम में डायाफ्राम NMJ पर अलग-अलग मोटर axons और myofibers की phenotypes के जांच करने के लिए उपयोगी है सब (या कम से कम कई / सबसे) myofibers के साथ रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं तथ्य यह है कि – और इस तरह के आंशिक और comple के रूप में चिकित्सा-प्रासंगिक morphological परिवर्तनते वितंत्रीभवन, पुनर्जन्म का अंकुरण और reinnervation। यह पेशी 9 भर में अलग-अलग NMJs की विस्तृत रूपात्मक आकलन के द्वारा पीछा किया, डायाफ्राम के पूरे माउंट immunohistochemistry (आईएचसी) के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। CMAPs का मेल और NMJ विश्लेषण मात्रात्मक सीएनएस और पीएन रोग के कृंतक मॉडल में मध्यपटीय विन्यास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
श्वसन समारोह सांस लेने और विशेष रूप से डायाफ्राम स्फूर्तिदान कि लक्ष्य के उपचारों के विकास, घाव एससीआई और ए एल एस दोनों में समझौता किया है के रूप में चिकित्सकीय 5,6 प्रासंगिक हैं। व्यापक श्वसन समारो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
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