Funzionale e morfologica Valutazione della membrana innervazione da Phrenic Motor Neurons
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia debilitante motoneurone associata con la perdita di entrambi i neuroni motori superiori ed inferiori e la conseguente paralisi muscolare. Dopo la diagnosi, la sopravvivenza del paziente è in media di soli 2-5 anni 1. Frenico motoneurone (PhMN) perdita è una componente fondamentale della patogenesi della SLA. I pazienti in ultima analisi, muoiono a causa della perdita di PhMN innervazione del diaframma, il muscolo principale di ispirazione 2,3. Traumatica lesioni del midollo spinale (SCI) è anche un problema serio con difficoltà respiratorie associate. Circa 12.000 nuovi casi di SCI si verificano ogni anno 4 a causa di danni traumatici al midollo spinale. Nonostante l'eterogeneità della malattia rispetto posizione, il tipo e la gravità, la maggior parte dei casi SCI comporta traumi al midollo spinale cervicale, che si traduce spesso in compromissione respiratoria debilitante e persistente. Oltre a ALS e SCI, altro sistema nervoso centrale (CNS) malattie può essere associato wesimo disfunzione respiratoria diaframmatica 5,6.
Il nervo frenico è un nervo motore efferente che innerva la emi-diaframma omolaterale e che proviene da corpi cellulari PhMN situati nei livelli C3-C5 della omolaterale midollo spinale cervicale. Uscita PhMN è controllato scendendo ingresso bulbospinal dal tronco cerebrale in una zona conosciuta come il gruppo rostrale ventrale respiratorio (rVRG) 7. Il circuito rVRG-PhMN diaframma è centrale per il controllo della respirazione inspiratori, così come altri comportamenti diaframma non ventilatorio. Varie lesioni traumatiche e malattie neurodegenerative che colpiscono questo circuito può portare a un profondo declino della funzione respiratoria e la qualità della vita del paziente. Scendendo ingresso PhMNs dalla sopravvivenza rVRG, PhMN, integrità nervo frenico e corretta innervazione a livello della giunzione neuromuscolare diaframma (NMJ) sono tutti necessari per il funzionamento della membrana normale. È quindi importante utilizzare tecniche chepuò quantitativamente valutare questo circuito in vivo in modelli di roditori di SLA, SCI e altre malattie del sistema nervoso centrale.
Con questo protocollo, l'obiettivo è quello di descrivere strumenti sperimentali per la valutazione PhMN innervazione del diaframma sia a elettrofisiologico e livello morfologico. Potenziali d'azione muscolare composto (CMAPs) sono registrati stimolando tutti gli assoni dei motoneuroni efferente di un dato nervo motore e poi analizzando la risposta di depolarizzazione suscitato delle miofibre bersaglio. Questa tecnica può essere utilizzata in vivo in ratti e topi anestetizzati per quantificare innervazione funzionale della emi-diaframma PhMNs 8. A causa del fatto che CMAPs rappresentano la registrazione simultanea di tutti (o almeno molti / maggior parte) myofibers dell'intero emi-membrana, è utile esaminare anche i fenotipi dei singoli motori assoni e miofibre al NMJ diaframma per monitorare malattie – e la terapia rilevanti cambiamenti morfologici, come parziale e complete denervazione, germinazione rigenerativa e reinnervazione. Questo può essere ottenuto tramite tutto il montaggio immunoistochimica (IHC) del diaframma, seguita da valutazione dettagliata morfologica delle singole NMJs tutto muscolo 9. Combinando CMAPs e analisi NMJ fornisce un approccio efficace per studiare quantitativamente innervazione diaframmatica in modelli di roditori di malattia SNC e SNP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dato che la funzione respiratoria è compromessa sia traumatico SIC e la SLA, lo sviluppo di terapie che hanno come target la respirazione e, in particolare innervazione diaframma sono clinicamente rilevante 5,6. Per studiare completo la funzione respiratoria, deve essere utilizzato un metodo di approccio combinato. CMAPs misurano il grado di innervazione funzionale del diaframma mediante stimolazione del nervo frenico esterno, ma drive respiratorio bulbospinal non endogena 8. Inoltre, queste regis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
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