Funksjonell og Morfologisk Vurdering av Membran Innervasjon av phrenic motoriske nerveceller
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en invalidiserende motor neuron sykdom forbundet med tap av både øvre og nedre motoriske nevroner og påfølgende muskellammelse. Ved diagnose, er overlevelses i gjennomsnitt bare 2-5 år en. Phrenic motor nevron (PhMN) tap er en kritisk komponent i patogenesen ved ALS. Pasienter som til slutt dør på grunn av tap av PhMN innervasjon av membranen, det primære muskelinspirasjons 2,3. Traumatisk ryggmargsskade (SCI) er også et alvorlig problem med tilhørende pustevansker. Omtrent 12.000 nye tilfeller av SCI oppstår hvert år 4 grunnet traumatiske skader på ryggmargen. Til tross for sykdom heterogenitet med hensyn til plassering, type og alvorlighetsgrad, de fleste av SCI tilfeller medføre traumer til cervical ryggmargen, noe som ofte resulterer i ødeleggende og vedvarende luft kompromiss. I tillegg til ALS og SCI, andre sentralnervesystemet (CNS) sykdommer kan knyttes with magen respiratorisk dysfunksjon 5,6.
Phrenic nerve er en efferent motor nerve som innervates ipsilaterale hemi-membran og som stammer fra PhMN celle organer ligger i C3-C5 nivåer av ipsilaterale cervical ryggmargen. PhMN produksjonen er kontrollert av synkende bulbospinal innspill fra hjernestammen i et område kjent som rostralt ventral åndedretts gruppe (rVRG) 7. Den rVRG-PhMN-membran krets er sentralt for kontroll av inspirasjons puste, samt andre ikke-ventilasjonsmembran atferd. Ulike traumatiske skader og nevrodegenerative lidelser som påvirker dette krets kan føre til en dyp nedgang i lungefunksjon og pasientens livskvalitet. Synkende innspill til PhMNs fra rVRG, PhMN overlevelse, phrenic nerve integritet og riktig innervasjon på membranen nevromuskulære krysset (NMJ) er alle nødvendige for normal membran funksjon. Det er derfor viktig å anvende teknikker somkan kvantitativt vurdere denne kretsen in vivo i gnagermodeller av ALS, SCI og andre CNS sykdommer.
Med denne protokollen, er målet å beskrive eksperimentelle verktøy for å vurdere PhMN innervasjon av membranen på både elektrofysiologiske og morfologiske nivåer. Sammensatte muskelaksjonspotensialer (CMAPs) registreres ved å stimulere alle efferent motor neuron axons av en gitt motor nerve og deretter analysere fremkalte depolarization responsen målet myofibers. Denne teknikken kan brukes in vivo hos bedøvede rotter og mus for å kvantifisere funksjonell innervasjon av hemi-diafragma ved PhMNs 8. På grunn av det faktum at CMAPs representerer samtidig registrering av alle (eller i det minste mange / de fleste) myofibers av hele hemi-membran, er det nyttig å også undersøke fenotyper av enkelte motoriske aksoner og myofibers på membranen NMJ for å spore sykdom – og terapirelevante morfologiske endringer som delvis og komplekserte denervering, regenerativ spirende og reinnervation. Dette kan gjøres via hel-mount immunhistokjemi (IHC) av membranen, etterfulgt av detalj morfologisk vurdering av den enkelte NMJs hele muskelen 9. Kombinere CMAPs og NMJ analysen gir en kraftig tilnærming for kvantitativt studere magen innervasjon i gnagermodeller av CNS og PNS sykdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som lungefunksjon er kompromittert i både traumatisk SCI og ALS, utvikle behandlingsformer som er rettet mot å puste og spesielt membran innervasjon er klinisk relevant 5,6. For å grundig studere lungefunksjon, bør en kombinert tilnærming metode brukes. CMAPs måle graden av funksjonell innervasjon av membranen ved hjelp av ytre phrenic nervestimulering, men ikke endogene bulbospinal respirasjonen 8. I tillegg har disse opptakene ikke tillater undersøkelse av morfologiske endringer på NMJ, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
