Funktionell och morfologisk Bedömning av Membran Innervation av Phrenic motorneuroner
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Amyotrofisk lateralskleros (ALS) är en försvagande motorneuronsjukdom associerad med förlusten av både övre och undre motoriska neuroner och åtföljande muskelförlamning. Vid diagnos är patientöverlevnad i genomsnitt bara 2-5 år 1. Phrenic motorneuron (PhMN) förlust är en kritisk komponent i patogenesen för ALS. Patienter i slutändan dör på grund av förlust av PhMN innervation av membranet, den primära muskeln inspirations 2,3. Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) är också ett allvarligt problem med tillhörande andningssvårigheter. Cirka 12.000 nya fall av SCI inträffar varje år 4 på grund av traumatisk skada på ryggmärgen. Trots sjukdom heterogenitet med avseende på plats, typ och svårighetsgrad, de flesta av SCI fall involverar trauma hals ryggmärgen, vilket ofta resulterar i försvagande och ihållande andningssvårigheter. Förutom ALS och SCI, andra centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar kan associeras wed diafragma andningsdysfunktion 5,6.
Den phrenic nerv är en efferenta motor nerv som innerverar ipsilaterala hemi-membran och som har sitt ursprung från PhMN cellkroppar ligger i C3-C5 nivåer av ipsilaterala hals ryggmärgen. PhMN utgång styrs av fallande bulbospinal input från hjärnstammen i ett område som kallas rostralt ventrala andnings grupp (rVRG) 7. Den rVRG-PhMN-membran kretsen är av central betydelse för kontroll av inandnings andning, liksom andra icke-ventilatoriska membran beteenden. Olika traumatiska skador och neurodegenerativa sjukdomar som påverkar dessa kretsar kan leda till en djup nedgång i lungfunktion och patientens livskvalitet. Fallande ingång till PhMNs från rVRG, PhMN överlevnad, phrenic nerv integritet och korrekt innervation på membran neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är alla nödvändiga för normal membranfunktion. Det är därför viktigt att använda tekniker somkan kvantitativt utvärdera denna krets in vivo i gnagarmodeller av ALS, SCI och andra CNS-sjukdomar.
Med detta protokoll, är målet att beskriva experimentella verktyg för att bedöma PhMN innervation av membranet på både elektrofysiologiska och morfologiska nivåer. Förening muskelaktionspotentialer (CMaps) registreras genom att stimulera alla efferenta motorneuron axoner av en given motor nerv och sedan analysera den framkallade depolarisation respons målet myofibers. Denna teknik kan användas in vivo i nedsövda råttor och möss för att kvantifiera funktionell innervation av hemi-membranet genom PhMNs 8. På grund av det faktum att CMaps representerar samtidig inspelning av alla (eller åtminstone många / de flesta) myofibers i hela hemi-membran, är det lämpligt att även undersöka fenotyper av enskilda motoriska axoner och myofibers på membran NMJ för att spåra sjukdomen – och terapi relevanta morfologiska förändringar såsom partiell och komplette denervering, regenerativ groning och reinnervation. Detta kan åstadkommas via hel-fäste immunohistokemi (IHC) av membranet, följt av detaljerad morfologisk bedömning av enskilda NMJs hela muskeln 9. Kombinera CMaps och NMJ analysen ger en kraftfull metod för att kvantitativt studera diaphragmatic innervation i gnagarmodeller av CNS och PNS sjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som lungfunktion äventyras både traumatisk SCI och ALS, utveckla behandlingar som riktar andning och specifikt membran innervation är kliniskt relevant 5,6. För att på ett heltäckande studera lungfunktion, bör ett kombinerat tillvägagångssätt metod användas. CMaps mäta graden av funktionell innervation av membranet med hjälp av extern phrenic nervstimulering, men inte endogen bulbospinal andningsdrift 8. Dessutom har dessa inspelningar inte tillåta granskning av morfologiska förändr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
