Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), üst ve alt motor nöron ve buna bağlı olarak, kas felci, hem kaybı ile bağlantılı bir zayıflatıcı motor nöron hastalığıdır. Tanı üzerine, hasta sağ kalım ortalama sadece 2-5 yıl 1 üzerindedir. Frenik motor nöron (PhMN) zarar ALS patogenezinde kritik bir bileşenidir. Hastalar sonuçta nedeniyle diyaframın PhMN innervasyonu, ilham 2,3 birincil kas kaybı ölmektedir. Travmatik omurilik yaralanması (SKY) da ilişkili solunum güçlüğü ile ciddi bir sorundur. SCI yaklaşık 12.000 yeni vaka nedeniyle omuriliğe travmatik hasar her yıl 4 oluşur. Konumu, türü ve şiddetine göre hastalık heterojenite rağmen, SCI vakaların çoğunluğu genellikle zayıflatıcı ve kalıcı solunum uzlaşma ile sonuçlanan servikal spinal kord, travma içerir. ALS ve SCI ek olarak, diğer merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları w ilişkilendirilebiliri'inci diyafragma solunum fonksiyon bozukluğu 5,6.
frenik sinir ipsilateral hemi-diyaframı innervates bir efferent motor sinir olduğunu ve aynı taraftaki servikal spinal kord C3-C5 düzeylerinde bulunan PhMN hücre gövdeleri kaynaklanır. PhMN çıkışı rostral ventral solunum grubunda (rVRG) 7 olarak bilinen bir bölgede beyin sapından bulbospinal girdi inen tarafından kontrol edilir. rVRG-PhMN-diyafram devre inspiratuar solunum yanı sıra diğer non-solunum diyafram davranışları kontrol merkezidir. Bu devrelere etkileyen çeşitli travmatik yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalıklar, solunum fonksiyon ve hastanın yaşam kalitesinde düşüşe derin yol açabilir. Diyafram nöromüsküler bileşke (NMJ) de rVRG, PhMN hayatta kalma, frenik sinir bütünlüğü ve uygun innervasyonunun gelen PhMNs girdi Azalan Normal diyafram fonksiyonu için gerekli tüm vardır. Bu teknikler istihdam nedenle önemli olduğunukantitatif ALS, omurilik yaralanması ve diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarının, kemirgen modellerinde in vivo olarak bu devre değerlendirebilir.
Bu protokol ile, hedef elektrofizyolojik ve morfolojik düzeyde hem de diyaframın PhMN innervasyonu değerlendirmek için deneysel araçları tanımlamaktır. Bileşik kas aksiyon potansiyelleri (Cmaps) verilen bir motor sinirin tüm efferent motor nöron aksonları uyarıcı ve daha sonra hedef myofibers bir ortaya çıkardı depolarizasyon tepkisini analiz ederek kaydedilir. Bu teknik, PhMNs 8 ile hemi-diyafram fonksiyonel innervasyon ölçmek için anestezi uygulanmış farelerde ve sıçanlarda in vivo olarak kullanılabilir. Nedeniyle Cmaps hemi-diyafram bütün, aynı zamanda hastalığa izlemek için diyafram NMJ bireysel motorlu akson ve myofibers fenotipleri incelemek yararlıdır tüm (ya da en azından birçok / en) myofibers eşzamanlı kayıt temsil gerçeği – ve bu tür parsiyel ve komple olarak tedavi açısından önemli morfolojik değişimlerte denervasyon, rejeneratif filizlenme ve reinnervation. Bu kas 9 genelinde bireysel NMJs detaylı morfolojik değerlendirmenin ardından, diyaframın tüm montaj immünohistokimya (İHK) üzerinden gerçekleştirilebilir. Cmaps birleştiren ve NMJ analiz nicel MSS ve PNS hastalığı kemirgen modellerinde diyafram innervasyon çalışmak için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Solunum fonksiyon solunum ve özellikle diyafram innervasyon hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, travmatik SKY ve ALS hem tehlikeye klinik olarak 5,6 alakalı. Kapsamlı solunum fonksiyonu çalışma için, bir birleşik yaklaşım yöntemi kullanılmalıdır. Cmaps dış frenik sinir stimülasyonu yoluyla diyaframın fonksiyonel inervasyonun derecesini ölçmek değil, endojen bulbospinal solunum sürücü 8. Buna ek olarak, bu kayıtlar, özellikle tek bir motor akson ve post-sinaptik asetilk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
