成对增长竞争测定法测定人类免疫缺陷病毒的复制健身
Summary
Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.
Abstract
In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.
Introduction
病毒复制健身被定义为病毒，以产生感染性子代在给定的环境1的能力，并在确定病毒的变体在群体水平的患病率随着时间的推移2的一个重要因素。作为体内健身研究是不致病的人类病毒，如HIV-1，各种体外和可行体外复制健身测定已开发研究从耐药性和免疫逃避突变，上位和进化所产生的健身效果病毒的人群3-6。在不同的健身测定法，生长竞争分析，确认得到的健身差别更敏感和有效的措施，为两个或更多的病毒变体竞争恰恰相同的环境条件下相同的细胞群，如发生在体内 1,7,8。开始增长竞争实验，几个variab前莱斯需要确定，包括使用不同感染多重性（MOI），病毒输入比，以及分析用取样定时。我们已经研究了这些参数对病毒生长动力学和上的竞争实验的结果的影响，并在细胞培养9确定所需的HIV-1的健身鲁棒测量的关键因素。
除了测定变量，有各种各样的用于定量在生长竞争实验的病毒变体的方法。散装10,11或克隆测序12,13已被用于确定基于在感兴趣的位点（多个）核苷酸频率竞争病毒的比例。相对适合从改变这个比例随着时间的推移得到。此方法是方便的DNA测序服务广泛提供。并行等位基因特异性测序（PASS）方法能够测序在多个位点和重组体14的检测</sup>，但它也需要专门开发的试剂和检测系统。本质上，开发了这些方法，研究病毒株具有少量的在感兴趣的区域的核苷酸差异。其他方法使用小报道基因15或同义突变4,16-18作为标记来区分竞争病毒通过测序，异源跟踪测定（HTA）4,7,17,19或逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR的）15,16,18,20，所有这些可以由适用于研究竞争菌株无关的序列相似性。一个附加的步骤是必需的，以引入标记插入病毒基因组和RT-qPCR分析也需要特定的试剂和仪器。我们已发现，散装Sanger测序产量比较的结果9。
继增长的竞争，病毒复制健身是作为相对健身，或T之间的比值健身WO病毒变种。病毒的相对适合度可以被定义为一种病毒变体通过在接种最初的比例或以两种相互竞争的病毒之间的净生长速率差标准化的最终比例。我们发现，后一方法中，使用仅在指数生长期纵向的数据点，产生了最健壮的结果9,20。
在体外实验健身主要用于研究生物克隆6-8和HIV-1感染性克隆的分子。后者，是适合于遗传操作，通常用于研究对从特定的突变或感兴趣3-5,21,22特定序列的健身效果。以下协议描述的工作流程从构建新的全长感染HIV-1的分子克隆用HIV-1载体含有序列标签，引入利益的突变，使得病毒的股票，建立的病毒生长动力学的角度，在执行的生长竞争测定和计算相对适合度（ 图1）。
使用我们的程序优化，我们创建了三个重组HIV-1突变体和确定其复制健身。首先构建通过更换pNL4-3，含有HIV-1毒株实验室的NL4-3全长基因组感染性的质粒的HIV-1 的gag-P24基因区域，用合成COTB（中心最先进重组分子克隆树，B亚型）GAG-P24序列23创建原型株。单个氨基酸变化（T186M，T242N和I256V），然后介绍了创建三个突变克隆。每个突变体竞争对原型病毒，观察在给定的遗传背景各突变的适合度的影响。这三种突变体展示不同的复制fsitness水平从轻微到比原型病毒显著降低。的T242N突变先前报道具有适度fitneSS花费24-26，类似于在这项研究中所示的结果。其他两个突变的适合度以前没有报道。
Protocol
注：该协议，如下所述，不包括任何病人身份信息，因此不认为人类受试者的研究由华盛顿大学的机构审查委员会或人类受试者司。 1.构建嵌合HIV-1 NL4-3分子的克隆 1.1）扩增出插入DNA片段的设计嵌合引物。二者的5'半部分的正向和反向引物含有一个HIV-1载体序列，所述片段将被插入其中。引物的3'一半必须包含插入序列（ 图2）的末端。确保嵌合引物序列保留了原来的开放阅读框。 使用的引物的至少20个碱基的长度，具有的熔融温度大于或等于60℃，〜50％的GC含量，和低的倾向，形成引物二聚体，异二聚体和/或发夹结构。评估这些属性使用OligoAnalyzer网络工具（ https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ）。 使用的PCR 27和嵌合引物以扩增插入DNA（ 图2）。对于每个PCR反应，使用1X高保真缓冲液，0.2毫米的dNTP，高保真DNA聚合酶1 U，0.5微米正向嵌合引物，0.5微米的反向嵌合引物，并进行插入区域DNA样品1 PG0 NG。加的dh 2 O至50μl的最终体积。 设定热循环步骤如下：在98℃下10秒进行初始DNA变性步骤。用DNA变性的30个循环扩增在98℃持续10秒和DNA退火在3℃以上的两种引物，持续20秒的最低熔解温度。执行一个最终延伸在72℃10分钟。商店PCR产物在4℃下。 取5微升的PCR产物前一步骤和运行琼脂糖凝胶电泳28。 使用0.7％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液（40mM的Tris-乙酸盐，1mM EDTA中），0.5微克/毫升溴化乙锭（EtBr）的最终浓度以及1kb梯作为DNA大小标记物。组电源电压到电极间5 V / cm的距离。停止电泳当加载染料迁移通过对凝胶长度的2/3。可视化使用凝胶记录系统28中的凝胶。 注：溴化乙锭是一种可疑的致癌物，必须妥善处置每机构管理条例。处理含有溴化乙锭凝胶手套时，应始终穿着。切换到包含材料处理完成后，乙锭新手套和办理其他材料或设备，以防止交叉污染之前。 如果只有一个具有对应于所期望的PCR产物的大小的DNA带被检测，纯化PCR产物使用商业试剂盒的其余部分如的QIAquick PCR纯化试剂盒符合荷兰国际集团制造商的协议。 如果其它的，非特异性条带也存在，可以使用PCR产物的其余部分运行制备型凝胶电泳。使用在步骤1.1.4中指定的相同的参数和条件。确保凝胶以及大到足以装入〜45微升的PCR产物。切出的感兴趣的频带，并提取从根据制造商的协议用QIAquick凝胶提取试剂盒凝胶中的DNA。 1.2）引入插入片段插入全长感染HIV-1 B亚型向量（pNL4-3） 从步骤1.1.5作为PCR引物使用PCR产物纯化。使用pNL4-3VifA 20作为模板DNA在一个PCR反应而使用pNL4-3VifB 20作为模板，在其它反应（ 图2）。每个PCR反应中，使用1×高保真缓冲液，0.2mM的的dNTPs，高保真DNA聚合酶2 U，500纳克引物的DNA，并在最终体积为50ng模板DNA的UME的50微升。设定热循环参数来：98℃30秒，35个循环的98℃，10秒，48℃1分钟和72℃下进行10分钟，随后72℃10分钟。 添加PCR反应的DPN 10 U I至50μl，37℃下1小时以消化模板DNA。确保该质粒DNA是从甲基化感受态细菌菌株， 例如分离的。，TOP10化学感受大肠杆菌 。 利用DPN I消化产物转化感受态细菌细胞。使用带有TOP10化学感受态热休克转型大肠杆菌 ，根据制造商的协议。要选择含重组质粒的细菌细胞，用含有100毫克/升羧苄青霉素的Luria肉汤（LB）培养板中。 挑〜10以及分隔菌落和含有100毫克/升羧苄青霉素在3ml LB液体培养基中单独生长每一个孵育在30℃下摇床O / N。 使用QIAprep离心微量制备试剂盒以从细菌液体培养分离质粒DNA，根据生产商的方案。 使用双酶切29，以确定质粒DNA是否包含正确的插入。确保的限制性位点存在一个只在插入区和其他限制性位点仅存在一次在HIV-1的载体中，插入区域之外。 消化至少300纳克在10微升最终反应体积质粒DNA。选择限制缓冲剂，温育温度和温育时间根据制造商的选择限制酶的协议。取9微升消化的DNA并运行凝胶电泳如步骤1.1.4中描述。选择具有预测大小的DNA条带重组质粒。 确认重组质粒通过Sanger测序的序列完整性。虽然少见，意外突变可以在PCR反应中被引入。 序列的质粒DNA的两条链。按照步骤1.1.1.1说明设计测序引物。此外，确保正向和反向测序引物退火的至少50碱基对的上游和所述插入区下游的重组质粒，分别。 提交质粒DNA和测序引物对市售的DNA测序服务提供商。所指定的服务提供者准备的DNA样品和引物。 使根据制造商的协议使用不含内毒素的质粒DNA试剂盒的突变的质粒DNA的无内毒素的库存。准备至少1微克的无内毒素的质粒DNA进行转染，在接下来的步骤。 1.3）引入小规模的突变通过定点突变设计诱变引物具有重叠的正向和反向含有所需mutat引离子（一种）。定位基座（S）以被取代，插入或在引物的中间，由10-15同源碱基侧翼删除。按照步骤1.1.1.1说明。 使用PCR合成突变质粒。每个PCR反应中，使用1×高保真缓冲液，10mM的dNTP，高保真DNA聚合酶2U，0.5μM正向诱变引物，0.5微米的反向诱变引物和50ng嵌合pNL4-3VifB，从步骤1.2.6 ，在50微升的最终体积。设定热循环参数来：98℃30秒，25个循环的98℃，10秒，48℃1分钟和72℃下进行10分钟，随后72℃10分钟。 重复步骤1.2.2至1.2.6。 2.生成病毒原料使用转计算所需病毒原料所需的质粒DNA的量。随着10 4 IU / ml以上，病毒滴度1.8病毒原料毫升就足够了两套增长竞争ASSAYS，包括monoinfections，各一式三份进行。为在一个6孔板做了转染，大约1.8毫升上清液每孔收获。质粒DNA1μg的是需要在一个6孔板进行每次转染。 为一个6孔板的每个孔中，制备100微升转染混合物， 例如的，由1微升的X tremeGENE 9转染试剂（或可比产品），1微克质粒DNA和无血清DMEM中。 确定所需质粒DNA的量，使用1微克质粒DNA，每孔。确保质粒DNA的终浓度为至少50纳克/微升。 确定有多少无血清培养基（DMEM）中，需要每使用公式很好：DMEM中在微升= 100μl总体积 – 中微升的DNA量。 添加10 6 HEK 293T-17（ATCC）细胞/孔在2ml传播介质（DMEM + 10％胎牛血清（FBS））的到6孔板中。在孵育1小时，在37℃下5％的CO 2气氛中。种子尽可能多的井需要（步骤2.1确定）。 为了制备转染混合物，分装的无血清DMEM中的适当体积，如上述计算，成1.8毫升聚丙烯微量离心管中，然后添加转染试剂。 试剂吸管直接进入媒体解决方案，不要把它添加到离心管中的塑料表面。加入质粒DNA最后。吸取向上和向下轻轻混合溶液。孵育在室温15分钟（15℃至25℃），以允许转染复合物的形成。 在逐滴方式加入该混合物中以细胞接种于6孔板中。轻轻摇动或转动井，以保证均匀分布的转染复合物。 密封板用保鲜膜。 在5％的CO 2气氛中孵育培养物在37℃下48小时。 使用移液管小心收集并转移上清至15ml试管THROUGH一个0.22微米的过滤器上。 使用移液管转移过滤的上清液的250微升以上至1.8 ml离心管中与橡胶垫圈的盖子。 储存在-80°C，直到使用过滤上清液。 3.确定在外周血单个核细胞病毒种群感染滴度（外周血单个核细胞） 刺激的PBMC与植物血凝素（PHA）。每一种病毒的库存，种子2×10 6个PBMC中在完整的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（cIMDM; IMDM补充有人白细胞介素2的20单位/毫升（人IL-2），10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素），补充用PHA（1.5微克/毫升）。种子的PBMC以2×10 6个细胞/ ml。在5％的CO 2气氛中孵育的PBMC在37℃下72小时。 嘉实PHA刺激的外周血单个核细胞。传送非粘附PHA-的PBMC到50ml锥形管中。旋管中于228×g离心10分钟。小心取出上清液没有disruptin克细胞沉淀。重悬细胞沉淀以达到2×10 5个PBMC中/在cIMDM ml的终浓度。 种子2×10 4个PHA刺激的PBMC /孔在100μl/孔cIMDM在圆底96孔板中。 做一个1:10的稀释病毒的股票。然后，从第一稀释股票，使12 3倍连续稀释在96孔模样板。这种稀释方案，推荐，用于检测病毒滴度在每毫升4月 10日至6月一十日感染单位（IU）的范围内。 例如，在1.5 ml管加入20微升病毒原液的180微升培养基。通过仔细吹打混合稀释。然后，90微升稀释股票转移到第一井180微升媒体和吹打拌匀。 通过将90微升从目前还有180微升媒体在未来还有11次以上继续稀释系列。增加或减少初始稀释，如果滴度大于10 6 IU / ml时或低于10 4 IU / ml的预期，分别。 加入40微升的连续稀释病毒的股票从主稀释板的外周血单个核细胞种子板（步骤3.3）一式四份。在5％的CO 2气氛中孵育板在37℃下16-24小时。 小心地从每个孔中除去100μl的上清液，并用160微升新鲜cIMDM替换为200微升的总体积/孔。孵育板在37℃，5％CO 2的气氛下（1天）。 天4，7，10和13传送来自每个孔的至100μl破碎缓冲液（2％的TritonX-100的PBS）100μl的上清，并更换用100μl的新鲜cIMDM。储存上清液在-20℃下。 采样保持和增加新鲜cIMDM每三天，直到滴度稳定。 确定病毒库存的p24 ELISA法的50％组织培养感染剂量（TCID 50），使用7天和13个样品中的步骤4中所述。 如果从第13天获得的TCID 50比从第7天的滴度明显地更高，病毒库存可能需要更长的时间来扩展。使用后的样品，直到从两个采样时间点的感染性滴度变得稳定（或减少），重复的p24 ELISA分析。选择股票从最高滴度样品。 4. ELISA（酶联免疫吸附测定）检测HIV-1的p24测定病毒感染性滴度注：以下协议是用在我们的实验室30准备p24抗原捕获板的发展。商用的HIV-1的p24 ELISA板/试剂盒也可使用，按照制造商的协议。 在此之前的样品工作，准备工作主要股票抗体（兔抗HIV-1 SF2 P24抗血清）。 解冻的p24的抗血清在室温下。 混合2.5毫升甘油用2ml 10％的FBS中phosphatË缓冲液（PBS）。 0.5毫升抗血清混匀。 商店1ml等份在-20℃。 解冻样品在37℃培养箱步骤3.7。 洗的p24捕获板5次洗涤缓冲液（1×PBS中含0.05％Tween-20）。 添加50μl/孔的样品稀释液（1％牛血清白蛋白（BSA），0.2％的Tween-20的RPMI-1640），然后加入50微升样品，以适当的孔中。包括至少三个井样品稀释液只能作为模拟/阴性对照。孵育2小时，在37°C或O / N在4℃。 准备主抗体溶液使用前新鲜。做一个1：2000倍稀释的主要抗体用一抗稀释液（在RPMI-1640 12％FBS）工作的股票。确保准备足够的用于在96孔板中使用的每各样品/对照孔100μl溶液。 例如，为了使足够的溶液一个96孔板中，添加5微升的主要抗体worki的纳克股第一抗体稀释剂为10 ml的终体积。 用洗涤液洗捕捉板5次。 加入100微升的初级抗体溶液的各孔中。在5％的CO 2气氛中孵育1小时，在37℃。 准备二次抗体溶液使用前新鲜。得到1：14,400倍稀释使用二次抗体稀释液（7％FBS，0.01％吐温-20的RPMI-1640）的第二抗体（1毫克/毫升的山羊抗兔HRP）的。为了减少移液误差，执行两步连续稀释。确保准备足够的用于在96孔板中使用的每各样品/对照孔100μl溶液。 例如，为了使足够的溶液一个96孔板中，首先加入1微升的二次抗体与99微升第二抗体稀释剂。然后加入70微升第一次稀释到次级抗体稀释为10 ml的终体积。 洗捕捉板5蒂姆ES与洗涤液。 添加100μl的第二抗体溶液，每孔。在5％的CO 2气氛中孵育1小时，在37℃。 洗涤板5次，洗涤缓冲液。 加入100微升RT TMB底物。孵育30分钟，在RT在封闭的容器避光。 加入100微升RT一站式解决方案（1 NH 2 SO 4）。 读吸光度在450-650毫微米用酶标仪各孔中。使用吸光度值进球每个以及感染或感染。考虑一个井含有感染性病毒如果吸光度值比从模拟/阴性对照孔中读取的值高至少三倍。计算病毒的股票采用里德- Meunch法31 TCID 50。 5.建立病毒生长动力学 5.1）Monoinfection 种子3×10 5 PHA刺激的PBMC /孔在48孔板S在500微升的总体积/孔。保持培养板在37℃在5％CO 2的气氛中，直至接种。 对于每一个病毒，制备含6000 IU在2毫升cIMDM的接种。 通过加入500微升接种物（1500 IU）的给接种的细胞接种的孔中一式三份。受感染的细胞培养物的最终体积为1毫升/井和MOI为0.005。 等份加入200μl剩余的接种物以每两个96孔板用于RNA分离，其中之一被保存作为备份的。 在5％的CO 2气氛中孵育培养物在37℃下16-24小时。 洗培养接种后16-24小时。 取下并丢弃750微升培养上清液。 加入750微升新鲜cIMDM。包装板保鲜膜和旋转在300×g的10分钟。取下并丢弃750微升上清。 加入750微升新鲜cIMDM。在37℃下用5％的CO 2在mosphere（1天）。 样品培养每天从2天到7天。 转移500μl的培养物上清液，以1.8毫升离心管中。旋在3000×g下1分钟。 转移200μl的无细胞上清液于两个96孔的样品板进行RNA分离，再保存一个板作为备份。商店上清于-80°C，直到RNA分离。 加入500μl新鲜cIMDM到每一种文化。在5％CO 2的气氛中在37℃。 丢弃培养成Wescodyne在实验结束。 从200微升上清液（使用市售试剂盒如QIAamp病毒RNA迷你试剂盒）按照制造商的标准方案分离RNA。对于大量的样品，使用Qiagen公司QIAxtractor。 商店的RNA样品在-80℃下直到cDNA合成。 5.2）cDNA合成（逆转录） 对于每一个RNA s充足，添加1.2纳摩尔的dNTP和1.2皮摩尔的cDNA合成引物，（5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3'，HXB2核苷酸7968至7995），以10微升的病毒RNA。加水到14微升的最终体积。轻弹管混合并短暂离心，在管的底部收集液体。 孵育混合物5分钟，在65℃，然后保持在4℃直至主混合物制备。 使用5×第一链缓冲单位RNAse的（250毫摩尔Tris盐酸，pH值8.3，375毫米氯化钾，15mM的MgCl 2的），5mM的DTT，120单位SuperScriptIII和240抑制剂制备主混合物。加水到10微升最终体积。 加入10μl反应混合液到RNA的混合物，轻弹混合和旋收集。 孵育混合物90分钟，在50℃，以允许合成cDNA。孵育15分钟，在70℃下灭活逆转录酶。根据需要保持在4℃。 已加入RNase H，一抖2 U混合，再旋收集。 孵育20分钟在37℃。商店的cDNA于-20℃。 5.3）基因定量使用定量PCR系统准备一个标准稀释系列。做10倍连续稀释，从3×10 6拷贝/μL降低到30份pNL4-3VifA的/微升。用蒸馏水稀释为。准备标准品稀释系列使用前新鲜或准备小批量，并保持在-20℃。不要冻融标准的三倍以上。 设置一个96孔的qPCR反应板。确保每个板包含至少一个以及阴性对照，标准品稀释系列的一式三份，并且至少每个cDNA样品的副本。 对于每个qPCR的反应，使用12.5微升的qPCR主混合物，0.2μM探针，每0.8微米的正向和反向引物和1μl的cDNA或标准稀释系列或水/缓冲液（阴性对照孔）。加水到25微升的最终体积。定量PCR探头光仙sitive。把它放在密闭容器中。 以检测的cDNA从pNL4-3VifA基于分子克隆的，使用的vifa引物 – 探针：VifAB正向引物（GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT），威发反向引物（5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3'）和VifAB探针（6FAM -5'- CTCCATTCTATGGAGACTC -3- “-MGBNFQ）。用于cDNA从pNL4-3VifB基于克隆的，使用VIFB引物 – 探针：VifAB正向引物，VifAB探针和VIFB反向引物（5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3'）。 设置PCR循环参数到50℃2分钟，95℃，10分钟，和40个循环的95℃15秒和60℃1分钟。咨询为定量PCR机器的操作制造商的支持文档。 计算使用来自一式三份的标准稀释系列数据的标准曲线。 cDNA样品的扩增数据进行比较，通过标准曲线来确定拷贝数。请教制造商的支持文档DATA处理。 5.4）测定病毒指数增长期绘制病毒生长动力学与取样日沿X轴和沿Y轴的cDNA拷贝数和识别病毒指数生长期， 即 ，当病毒cDNA拷贝数的增加以指数级数。 使用GRC网络工具（ http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ）来计算病毒生长率（G）。在本申请中，GRC工具接受的cDNA从至少两个时间点拷贝数作为输入，并输出该病毒生长率（ 克）。仅使用时间点数据的指数生长期内（见上文步骤5.4.1），以获得准确的增长率。在GRC web工具所使用的数学模型的详细说明，请参阅20。 6.成长竞争测定法种子3×10 5 </ SUP> PHA刺激的PBMC（或1×10 5 CEMx174细胞）在48孔平底板每孔500微升的总体积。 保持板在37℃在5％CO 2的气氛中，直至接种。 对于每一个病毒，准备3ml含6000 IU接种。 转移1.5ml每种病毒接种物，以无菌管以创建双重感染接种物。加入500μl双接种（1500 IU），以3×10 5个细胞的48孔板中。最终培养体积为1毫升/孔。等份加入200μl接种到两个96孔板用于RNA分离;一个板块保存作为备份。 孵育接种的细胞在37℃用5％CO 2的气氛中进行16-24小时。 洗培养接种后16-24小时。 取下并丢弃750微升培养上清液。 加入750微升新鲜cIMDM。包装板保鲜膜和旋转在300×g的10分钟。删除和丢弃75081，L上清液。 加入750微升新鲜cIMDM。在37℃下用5％的CO 2气氛（1天）。 选择采样时间，包括在步骤5.4.1中观察到的指数生长期内的至少3个时间点。 对于每个采样，按照步骤5.1.7。 如在5.2节所述进行cDNA合成。 确定采用定量PCR病毒的变异率。 配制标准系列稀释一式三份，从3×10 6拷贝的每一步稀释10倍/微升至30拷贝/微升pNL4-3VifA的。 设置一个96孔的qPCR反应板。确保每个板包含至少一个阴性对照，标准品稀释系列，一式三份，并且每个cDNA样品的重复。 对于每个qPCR的反应，使用12.5微升的qPCR预混，0.2μM探针，每0.8微米的正向和反向引物和1μl的cDNA或标准D ilution系列或水/缓冲液（阴性对照孔）。加水到25微升的最终体积。该探针定量PCR对光敏感，保持它在密闭容器中。 使用的vifa引物 – 探针来检测在阴性对照和标准品稀释系列和与cDNA样品中的一个重复的信号。使用VIFB引物 – 探针与cDNA样品的其他重复。 设置PCR循环参数到50℃2分钟，然后95℃进行10分钟，然后在95℃的40个循环持续15秒和60℃1分钟。咨询为定量PCR机器的操作制造商的支持文档。 计算使用从标准稀释系列的扩增数据的标准曲线。的cDNA样品的扩增数据进行比较，通过标准曲线来确定拷贝数。咨询数据处理制造商的支持文档。 使用GRC网络工具（ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/）计算相对病毒健身（D）。 注：GRC工具接受的cDNA从至少两个时间点拷贝数或色谱峰高作为输入，并输出这两种病毒之间的净生长速率差（d）所示 。而该工具可以计算从两个时间点数据的净生长速率，强烈从三个或更多个时间点，建议输入的数据。仅使用从指数生长期内的时间点获得的数据（参见步骤5.4），以获得准确的增长率。在GRC web工具所使用的数学模型的详细说明，请参阅20。 确定病毒的比率使用色谱峰的高度 PCR扩增的HIV-1 的vif片段含有用VifFwd的VifAB序列标签（5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3'; HXB2位置5266-5291）和VifRev引物（5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3'; HXB2位置5579-5553）。 每个PCR反应中，使用1微升的cDNA，1×NH 4缓冲液，每个引物为1.5mM的MgCl 2，0.2 10mM的dNTP，2.5单位Taq聚合酶，和0.45微米。加水到50微升的最终体积。 设置PCR循环参数以3个循环的94℃1分钟，55℃1分钟，和70℃进行1分钟，然后是34个循环的94℃15秒，58℃30秒，并70℃进行1分钟，然后保持在4℃。 净化根据制造商的方案使用QIAquick PCR纯化试剂盒的PCR产物。 提交纯化的PCR产物的DNA测序服务提供商Sanger测序。 检查平均读取质量得分，应由测序服务来提供。如果平均通话基地精度小于85％，重做一步6.10.1 6.10.3来使用ChromatQuan网络工具（f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi )计算病毒的比例在每个时间点。该工具需要序列跟踪文件（* .ab1）和序列5'到感兴趣的核苷酸位点。该工具测量在指定网站上的峰值强度。的峰强度的比对应于这两种病毒（ 图4B）的定量。 使用GRC web工具（ http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ）和记录的峰强度作为输入来计算的病毒相对适合度（d）所示 。见步骤6.10.6。20
Representative Results
研究的单氨基酸改变的适应度的影响在HIV-1的Gag-p24的，我们使用寡核苷酸定向诱变，以引入突变到含有HIV-1的COTB-p24的基因23,32,33一个pNL4-3质粒。通过293T细胞的转染产生和48小时后收获病毒母液。我们估计每个病毒的股票的50％组织培养感染剂量（TCID 50）的里德- Muench的方法31。原型的TCID 50和突变病毒介于10月4日至10月五日国际单位/毫升（ 图3A）。 的重组病毒的生长动力学建立在PBMC中从以0.005的MOI单一供体。 RT-qPCR方法每天测量病毒cDNA拷贝数6天。所有突变体和病毒的原型成倍增长2日和4日，随后病毒增长放缓，由病毒RNA拷贝数的增加降低斜率（指示与<STRONG>图3B）。在cDNA中的减少复制0天（相应于接种物）和第2天之间数是由于病毒的吸收，细胞和由第1天洗涤（步骤5.1.6）去除未结合的病毒粒子。在指数生长期中，所有三个突变体具有更慢的生长速率（ 克 ）比原型病毒（ 图3C）。 所有这三个突变体对竞争的原型病毒生长竞争测定为0.005，总MOI。在双重感染病毒培养生长动力学是类似于monoinfection的;病毒指数生长期为2和4天之间，和病毒生长达到约5天（ 图4A）平台期。 病毒生长速率的差异来源于在病毒比率随时间的变化。基于参考的cDNA拷贝数和利用RT-qPCR的，突变的病毒和通过比较峰高的病毒比计算在序列色谱图在核苷酸位点区分这两种病毒（ 图4B）。使用峰高和病毒RNA的拷贝数的方法来确定的生长速率的差异，得到了类似的结果（ 图4C）。所有三种突变体具有比原型病毒与具有最低健身（ 图4C）的突变I256V下复制健身。 图1：在这个文件中提出的协议流程图的HIV-1重组克隆病毒制剂协议建设的关注个股病毒和生成。健身化验协议是建立病毒的生长动力学，并确定相对病毒健身。虚线表示的协议备选流。例如，一个突变可直接引入HIV-1的NL4-3分子克隆，但不产生重组克隆。 图2：采用重叠延伸PCR（A）的HIV-1 NL4-3 COTB的Gag-P24重组分子克隆施工图设计嵌合引物。 5'引物半部包含NL4-3矢量序列和3'半部分包含插入序列的两端。 （B）的嵌合引物用于扩增插入片段，COTB的Gag的p24。 （C）的插入片段被用作引物用于第二次PCR以产生新的重组质粒。 图3：外周血单个核细胞中的病毒生长特点 （ 一 ）登录10 TCID 50 </sUB>病毒股票。 （ 二）monoinfections病毒生长动力学开始以MOI = 0.005。 （C）的病毒生长率超过六天，包括从面板（B）中得到的指数生长期（2-4天）。显示的值代表从一个实验的三次重复的平均值。误差线代表95％置信区间。 图4：病毒生长和相对适合测定的 （A）双重感染PBMC培养物的病毒生长的影响。的T242N和原型病毒（B）比率使用RT-qPCR的或测序峰高度的方法测定。 （C）的突变和双重感染的文化原型病毒之间的病毒净增长速度的差异（D），如图（A）。分别计算F D值ROM中的（B）示出的病毒比数据。显示的值代表从一个实验的三次重复的平均值。误差线代表95％置信区间。
Discussion
提出的方案包括两个主要部分：施工重组HIV-1分子克隆和增长竞争分析。为了区分这两种病毒在一个双重感染的细胞培养，但重要的是相互竞争的分子克隆含有序列标签，这可以通过一个RT-qPCR的引物 – 探针测定法或通过Sanger测序来检测。这个协议利用了VIFA和VIFB标签，它们占据的HIV-1的NL4-3 的vif同一区域和编码相同氨基酸序列，但相差6同义突变。这些突变显示不影响 病毒复制健身20。在这个协议中使用的基于PCR的克隆方法在选择的克隆位点提供了更多的灵活性，相对于限制性位点克隆。然而，PCR克隆的效率降低为插入尺寸增大。插入大小的电流限制为5〜34 KB。用于基于PCR的克隆和位点定向mutagenesis时，使用高保真DNA聚合酶的关键是减少的额外的突变的可能性。使用得到的产品足够量的所需要的PCR循环的最小数目的还建议。根据我们的经验，我们没有发现这里所描述的基于PCR的克隆和位点定向诱变步骤后的任何额外突变。尽管如此，PCR产物应测序，以检查是否有任何不希望的突变。理想的情况下，整个的HIV编码区应当重新测序。
至少三个采样时间点应该在指数生长期9内进行检查。该病毒生长动力学必须首先使用每日取样，以确定适当的培养周期和采样时间点的成长竞争建立。影响病毒生长动力学的一个因素是感染复数（MOI）的多重性。该协议使用的0.005共MOI为monoinfection和增长的竞争，因为它被证明产生更多的RO胸围结果低于9的MOI。尽管如此，低的MOI可用于在必要时，得到较长的指数增长阶段，但在结果的一致性为代价的。这个协议建议的50:50的初始感染比率，假定的病毒适应度差异一般未知预先。然而，使用不相等的输入比率是合适的时，有初步数据表明在病毒复制动力学显著差异。在这些情况下，以70:30的感染比率，推荐以允许大型健身差的检测，其中所述不太适合病毒被放置在过量9。
该协议确定TCID 50，病毒生长动力学，以及用于执行使用HIV-1的B亚型的生长竞争试验进行了优化，NL4-3 COTB-p24和来自单一供体的外周血单个核细胞的PBMC已经证明一致易感性艾滋毒1感染在体外 。培养期并在这个协议中提出的采样时间点都可能是适合研究HIV-1的M组病毒在人PBMC。使用的PBMC来自单一来源，强烈建议，以获得一致的结果作为病毒复制可以在不同的供体细胞35而变化。尽管不太希望，PBMC中从多个供体汇集的可以用作一个替代条件是相同的池用于所有的实验。另一种替代方法是使用细胞系。这里介绍的协议被成功用于与T细胞系CEMx174 23,36。但是，重要的是，细胞接种的号码重新优化以实现一致的细胞生长。病毒生长动力学，还必须重新建立的，因为它很可能在不同的细胞系而异，在生长竞争步骤，以确定适当的采样时间点。
两种不同的方法来确定病毒比率用于计算健身都包含在protoc醇。第一种方法使用RT-qPCR的测量病毒cDNA拷贝数在每个采样时间点。病毒复制健身然后从病毒比计算，是根据cDNA的拷贝数。可替代地，病毒比率可以基于色谱峰高在VifAB标签位点的比值来确定。这两种方法产生了类似的结果（ 图4）。色谱峰高度的方法可以适用于其它HIV-1病毒株未经改造的序列标签。用于RT-qPCR的，使用引物或探针来区分病毒变异体必须首先仔细评估（见20）。然而，RT-qPCR的提供用少量的病毒RNA，如那些从指数生长期中的第一个时间点样品的灵敏度。病毒cDNA的直接测量还可以检测可能产生的RNA提取和cDNA合成技术问题。利用分子克隆与序列标签提供一个具有成本效益的解决方案牛逼澳RT-qPCR的方法，因为只需要两对引物和探针来研究多种病毒。这一策略也避免了高峰高度变化的顺序问题色谱图，由于邻近的基地37，测序完成在该研究中所有的病毒在同一网站。制备用于RT-qPCR的和Sanger测序PCR产物也可以是与其他方法使用，以确定病毒的比例如本体测序单个克隆12,13，HTA 4,7,17,19，或寡核苷酸连接测定法（OLA）38 。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington’s Center for AIDS Research (P30 AI027757).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Construction of recombinant clones | |||
| Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers | IDT | N/A | Custom DNA oligos |
| pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid | N/A | N/A | Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu) |
| High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F-549S | |
| High-fidelity buffer | Thermo Scientific | F-549S | |
| dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
| Thermal cycler | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700 |
| DNA loading dye | Thermo Scientific | R0631 | |
| 1kb Plus DNA ladder | Invitrogen | 10787-018 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DpnI enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
| TOP10 chemically competent Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Luria Broth base powder | Invitrogen | 12795-084 | |
| Carbenicillin | Research Products International | C46000-25.0 | |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Transfection | |||
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 6365787001 | |
| HEK 293T-17 | ATCC | CRL-11268 | http://www.atcc.org/ |
| 0.22um filter top tube | VWR International | 89220-716 | |
| Cell culture | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566016 | |
| Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) | Life Technologies | 31980-030 | |
| RPMI-1640 media | Life Technologies | 61870-036 | |
| Phytohemagglutinin (PHA) | Thermo Scientific | R30852801 | |
| Human Interleukin-2 | Roche | 11147528001 | |
| Fetal bovine serum | JR Scientific | 43640 | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning Cellgro | 30-001-CI | |
| 6 well plate | VWR Scientific | 73520-906 | |
| 48 well plate | VWR Scientific | 62407-338 | |
| 96 well flat-bottomed plate | ISC Bioexpress | T-3015-4 | |
| 96 well round-bottomed plate | BD Falcon | 353077 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Mt. Baker Bio | MBD-1500 | |
| 1.5 mL tubes w/ O-ring | VWR Scientific | 89004-290 | |
| 50 mL conical tube | ISC Bioexpress | C-3317-6 | |
| ELISA | |||
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum | NIH AIDS Reagent Program | 4250 | |
| Goat anti-rabbit HRP | KPL | 474-1516 | |
| TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-01 | |
| H2SO4 | Fisher Scientific | A300-500 | Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes. |
| HIV p24 standard | AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) | N/A | For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx |
| Microplate reader | Molecular Devices | N/A | VMax Kinetic ELISA Microplate Reader |
| RNA isolation cDNA synthesis | |||
| QIAxtractor | Qiagen | N/A | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | |
| dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
| SuperscriptIII | Invitrogen | 18080-085 | |
| First-strand buffer | Invitrogen | 18080-085 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
| Rnase inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| RnaseH | Invitrogen | 18021-071 | |
| qPCR | |||
| Real-time qPCR machine | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR |
| TaqMan® Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Forward, reverse primer | IDT | N/A | Custom order |
| Probe | Life Technologies | N/A | Custom order |
| optical 96 well reaction plate | Life Technologies | I19N3Q216 | |
| PCR+sequencing | |||
| Taq DNA polymerase (Biolase) | Bioline | Bio-21043 | |
| NH4 buffer | Bioline | Bio-21043 | |
| MgCl2 | Bioline | Bio-21043 | |
| Sequencing primer | IDT | N/A | Custom order |
| QIAxcel | Qiagen | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system | |
| DNA sequencing service provider | http://www.htseq.org/ | ||
| GRC web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ | ||
| ChromatQuan web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi |
References
- Domingo, E., Holland, J. J. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).
- Domingo, E. Mechanisms of viral emergence. Veterinary research. 41 (6), 38 (2010).
- Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo. Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).
- Troyer, R. M. Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. PLoS Pathog. 5 (4), e1000365 (2009).
- Rolland, M. Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics. PLoS One. 5 (9), e12463 (2010).
- Abraha, A. CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic. J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).
- Quinones-Mateu, M. E. A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression. J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).
- Ball, S. C. Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes. B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).
- Lanxon-Cookson, E. C. Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses. J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).
- Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine. J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).
- Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation. J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).
- Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D’Aquila, R. T. Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).
- Wang, J. The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency. Virology. 348 (2), 462-474 (2006).
- Song, H. Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome. Retrovirology. 9 (89), (2012).
- Ali, A., Yang, O. A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay. Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).
- Maarseveen, N. M. A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants. J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).
- Liu, Y. Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape. J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).
- Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).
- Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness. Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).
- Liu, Y. A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture. J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).
- Brumme, Z. L. Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers. J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).
- Nomura, S. Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in. Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).
- Rolland, M. HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity. J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).
- Martinez-Picado, J. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).
- Brockman, M. A. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).
- Miura, T. HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).
- McClure, J., van’t Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density. J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimatingfifty percent endpoints. Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).
- Nickle, D. C. Consensus and ancestral state HIV vaccines. Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).
- Rolland, M. Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).
- Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
- Spira, A. I., Ho, D. D. Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro. J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).
- Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface. PLoS One. 8 (6), e66065 (2013).
- Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing. Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).
- Lalonde, M. S. Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies. J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).
Cite This Article
Manocheewa, S., Lanxon-Cookson, E. C., Liu, Y., Swain, J. V., McClure, J., Rao, U., Maust, B., Deng, W., Sunshine, J. E., Kim, M., Rolland, M., Mullins, J. I. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (99), e52610, doi:10.3791/52610 (2015).