Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.
Den bananfluga Drosophila melanogaster är en av de främsta modellorganismer för att studera funktion och utvecklingen av immunförsvaret. Många aspekter av medfödd immunitet är konserverade mellan insekter och däggdjur, och eftersom Drosophila lätt kan genetiskt och experimentellt manipulerade, de är kraftfulla för att studera immunsystemets funktion och fysiologiska konsekvenserna av sjukdomen. Förfarandet visat här tillåter infektion av flugor genom införande av bakterier direkt in i kroppen hålighet, förbi epiteliala barriärer och mer passiva former av försvar och låta fokus på systemisk infektion. Förfarandet innefattar protokoll för mätnings hastigheter av värd dödlighet, systemisk patogen belastning, och graden av induktion av värdimmunsystemet. Denna infektion förfarande är billig, robust och kvantitativt repeterbara, och kan användas i studier av funktionella genetik, evolutionär livshistoria och fysiologi.
Den bananfluga Drosophila melanogaster är en av de främsta modellorganismer för att studera funktion och utvecklingen av immunförsvaret. Drosophila är billiga och lätta att bak, är mycket mottagliga för experimentell manipulation, och backas upp av en omfattande vetenskaplig gemenskap som har utvecklat ett brett samling av forskningsverktyg. Många aspekter av medfödd immunitet är konserverade mellan insekter och däggdjur, inklusive signaltransduktion medierad av Toll-liknande receptorer och NF-kB familj transkriptionsfaktorer, JAK / STAT-signalering, och JNK pathway svar. 1,2 Funktionen hos dessa gener och vägar kan frågas i D. melanogaster använder mutationer eller RNAi knockdowns som ökar eller minskar pathway aktiviteter 3 -. 6 Dessutom Drosophila kan användas för att studera de fysiologiska följderna av infektioner och sjukdomar, bland annat i samband med evolutionära livshistorieteori 7.– 9 Alla sådana studier dock bero på förmågan att på ett tillförlitligt sätt infektera experimentella flugor under definierade behandlingsförhållanden. Det förfarande som beskrivs här utgör en metodologisk ram för att leverera robusta och repeterbara bakterieinfektioner till Drosophila melanogaster och därefter mäta infektion svårighetsgrad och kvantifiera värdens immunsvar.
Drosophila kan vara naturligt och experimentellt smittats av ett brett utbud av parasiter och patogener, inklusive bakterier, svampar, virus, nematoder och parasitoid getingar. Den nuvarande protokollet är inriktad på att leverera system bakteriell infektion. Många olika bakterier kan användas för att infektera flugor, och försöksledaren val bör baseras på de exakta vetenskapliga frågor ställs. Exempelvis kan humana kliniska isolat användas för att studera bakteriella virulensen mekanismer 10, eller ekologiskt relevanta isolat kan vara preferred för evolutionära studier. 11 Vissa bakterier är kompetenta patogener i D. melanogaster, frodas vid infektion och orsakar värd sjukdom eller död. Andra bakterier effektivt förvaltas av värdens immunsystem och rensas inom ett par dagar. I denna demonstration kommer Providencia rettgeri användas som en proliferativ patogen som kan orsaka värd dödlighet och kvarstår i överlevande värdar. Escherichia coli kommer att användas som en icke-patogen som godkänts av värdens immunsystem.
Infektion kommer att fastställas genom införande av bakterier direkt in i kroppen hålighet av flugan. Detta tillvägagångssätt kringgår epiteliala barriärer och skydds beteenden, så att undersökning av systemisk infektion oavsett naturliga överföringsteknik. Det finns två huvudsakliga metoder för att experimentellt upprättandet systemisk infektion. I det första, en nanoinjector och dras glas kapillära nålar används för att injicera ett exakt antalbakterier i farten. Denna metod har fördelen av att tillåta ett stort dynamiskt omfång av infektionsdoser och att vara kvantitativt hög repeterbarhet. Den andra metoden är att leverera infektion med en septisk nålstick. Detta tillvägagångssätt har fördelarna av att vara snabb och kräver ingen speciell utrustning. När infektioner är etablerade, blir det möjligt att mäta system patogen belastning, värd dödlighet, och inducerbara immunsystemaktivitet. Naturligtvis kan vilket som helst antal ytterligare fenotyper tänkas mätas i infekterade D. melanogaster, inklusive efter infektion fruktsamhet 12, inlärningsförmåga 13, metabolisk status 14, eller nästan alla andra drag som kan föreställa sig.
Tillvägagångssättet som beskrivs här ger rigorös och hög kvalitet infektion av Drosophila melanogaster. De illustrerade exemplen främst inriktat på infektion med Providencia rettgeri och E. coli, men protokollet är mycket anpassningsbar och kan tillämpas på infektioner med olika bakterier över ett intervall av värd uppfödning och underhållsförhållanden.
Detaljerna för en optimal experimentell strategi kommer att bero på den bakterie som användes för infektion, genotyp av värden, och de generella experimentella betingelser. Det är starkt rekommenderat att pilottest nya experimentella betingelser före initiering mer ambitiösa projekt. En bra utgångspunkt är att testa tre infektions doser under en 100-faldigt område. Mycket virulenta patogener är ofta bäst införes vid mycket låga infektiösa doser, av storleksordningen 10 till 100 bakterieceller per fluga. Mer moderata patogener kan injiceras vid högre doser av cirka 1.000 bakterier per fly, och icke-patogener kan injiceras vid doser så höga som 10.000 bakterier per fluga. Det är ofta lärorikt att definiera kinetiken av nya infektioner genom att spåra patogener belastning, värd dödlighet, och immunsystemet aktivitet under en longitudinell tidsserier. Eftersom mätningen av patogen belastning och värd genexpression är destruktiva analyser, är det nödvändigt att infektera distinkta flugor i början av experimentet för varje tidpunkt som skall mätas.
När beslut fattas om att använda nålstick eller mikrokapillär baserade injektion, är det viktigt att notera att det finns fördelar och begränsningar för varje metod. Capillary injektion införs en volym av vätska i farten, som både blygsamt ökar saftspänningen och introducerar salter eller andra molekyler som är suspenderade eller upplösta i bäraren. Kapillär injektion kräver också tillgång till en injektionsanläggningen eller köp av den nödvändiga utrustningen. Septic nålstick kräver ingen speciell utrustning och introducerarförsumbara media i farten, och är oftast mer effektivt för att infektera ett stort antal flugor. Emellertid inte NÅLSTICK infektioner inte tillåta exakt kontroll över infektions dos som kan uppnås med kapillär injektion. Det nuvarande protokollet fokuserade på en injektionsanordning som mekaniskt reglerar injektionsvolym, men det finns också insprutningssystem baserade på diskreta pulser av trycksatt luft. 20,21 Dessa är typiskt dyrare än anordningen som visas här och kräver kalibrering av luftpuls till varje nål för att säkerställa injektions konsekvent volymer.
Det finns en betydande debatt men mycket få uppgifter om hur flugor blir systemiskt infekterade med bakterier i naturen. Vissa utredare posit att majoriteten av naturliga infektioner uppstå när Drosophila ingest patogena bakterier och bakterier är därefter i stånd att undkomma tarmen att etablera en systemisk infektion. Det finns dock mycket few bakterier kända för att kunna passera tarmen hos D. melanogaster, och de som har denna förmåga är mycket dödlig för flugor 22,23. En alternativ teori är som flyger regelbundet upprätthålla cuticular skador genom flykt från misslyckade predation försök eller angrepp av ektoparasitära kvalster. Denna hypotes stöds av frekvent insamling vilda D. melanogaster lagermelanin fläckar som indikerar läkta sår (opublicerade observationer). Kvalster har visat att sända bakteriella infektioner i Drosophila 24 och sår kvar av kvalster kan sekundärt infekteras av bakterier i honungsbin 25. Frekvensen i naturen av kvalsterdrivna eller på annat opportunistisk infektion i D. melanogaster genom nagelband brott är inte känd. Protokollet som beskrivs här tillåter införsel av bakterier direkt i hemolymfa genom kvantitativ injektion som kringgår alla epiteliala barriärer eller beteende IMMUskapen. Metoder för matning av patogena bakterier till D. melanogaster har beskrivits i et al., Vodovar 22 och Nehme et al., 23.
Många entomopatogena bakterier utgör liten eller ingen risk för människors hälsa, vilket gör att forskare att arbeta med dem bekvämt. Dessutom mycket få bakterier har förmåga att infektera Drosophila vid kontakt utan experimentella ingripande, så risken för "epidemi" spridning av bakteriell infektion genom ett laboratorium via förorenade ytor eller rymt flugor är generellt mycket låg. Ändå är det lämpligt att se till att tillräckliga inneslutningsåtgärder har vidtagits för att förhindra infekterade flugor från att fly och för att återta någon rymt flugor. Laboratoriet bör utrustas med en biologisk säkerhetsnivå i proportion till det av patogener som används, och standard bästa praxis i mikrobiologi bör användas.
Den experimentella infectipå metoden som beskrivs här tillåter infektioner i Drosophila melanogaster med någon dos av godtycklig bakterie. När infektionen har fastställts, är det enkelt att mäta kinetiken av bakteriell spridning eller godkännande, för att spåra värd dödlighet, och att analysera induktion av värdens immunsystem. Infekterade flugor kan lätt utsättas för andra fenotypiska analyser, inklusive tester av fysiologiska funktioner som kan forma eller formas av infektionen. De förfaranden som beskrivs är billigt, kräver relativt lite specialutrustning, och lättlärd, vilket gör dem lämpade för användning i olika projekt över en bredd av forskning och undervisning labb.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.
Reagent | Company | Part Number |
Incubator | Powers Scientific, Inc | DROS52SD |
Paintbrush | ||
CO2 Flypads | FlyStuff | 59-114 |
CO2 | Airgas | CD FG50 |
Drosophila rearing mix | ||
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 |
Nosterile Extra Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-882 |
Microscope | Olympus Corporation | SZ51 |
Drosophila Vials polystyrene | VWR international | 89092-720 |
Nosterile Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-883 |
2L flask | VWR international | 89000-370 |
Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm; | VWR international | 25384-302 |
LB Agar, Miller | Difco | 244520 |
Innoculing Loop | VWR international | 80094-488 |
Rainin Clasic Pipettes in various sizes 0.1 µl to 2 µl, 2 µl to 20 µl, 20 µl to 200 µl, 100 µl to 1000 |
Rainin | PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000 |
Micropipette tips (assorted sizes) | VWR international | 30128-376 53503-810 16466-008 |
Luria Broth Base, Miller | Difco | 241420 |
Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass | VWR international | 47729-576 |
S-500 Orbital Shaker | VWR international | 14005-830 |
centrifuge | VWR international | 37001-300 |
PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 |
SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 |
Semimicrovolume Cuvettes | Bio-Rad | 223-9955 |
Vertical Capillary Puller | Kopf Needle Pipette Puller | |
3.5'' Replacement glass Capillaries for Nanojet II | Drummond Sientific Company | 3-000-203-G/X |
Nanoject II | Drummond Sientific Company | 3-000-204 |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
10mL Syringe | BD | 309604 |
Mineral Oil, White, light | Macron Fine Chemicals | 6358-10 |
minutein pins | Fine Science Tools | 26002-10 |
1.5mL Microcentrifuge tubes; Seal Rite | USA Scientific Inc. | 1615-5500 |
Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer | Troemner | 103 |
Talboys High Throughput Homogenizer | OPS Diagnostics | 930145 |
5/32'' Grinding Balls | OPS Diagnostics | GBSS 156-5000-01 |
Vortex Genie | Scientific indurstries inc. | G560 |
Multichannel Pipettor (10uL-300uL) | Sartorius | 730360 |
WASP2 Whitley Automated Spiral Plater | Microbiology International | |
ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader | Microbiology International | |
TRIzol | Life Technologies | 15596-026 |
qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips | Bio-Rad | TLS0801 |
qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips | Bio-Rad | TCS0803 |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | m610a |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | m170b |
dNTPs | Promega | U1240 |
Oligo-dT | IDT | |
SsoAdvanced SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5260 |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5200 |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2115 |