تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي
Summary
Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
Abstract
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Introduction
الكمي تضخيم الحمض النووي هو تقنية هامة للكشف عن البيئي، وتنتقل عن طريق الأغذية، ومسببات الأمراض التي تنقلها المياه فضلا عن التشخيص السريري. في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل الكمي رد فعل (QPCR) هو الأسلوب معيار الذهب للكشف عن حساسية ومحددة، وكمية من الأحماض النووية، على سبيل المثال، لHIV-1 اختبار الحمل الفيروسي، والكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية، والكشف عن العديد من الكائنات الحية الأخرى 1 – 3. خلال الوقت الحقيقي QPCR، الاشعال تضخيم DNA الممرض في دورات، ويتم إنشاء إشارة الفلورسنت التي تتناسب مع كمية من الحمض النووي تضخيم في العينة في كل دورة. عينة تحتوي على تركيز غير معروف من DNA الممرض قد يكون كميا باستخدام منحنى القياسية التي تتعلق تركيز الحمض النووي الأولي من العينات القياسية والوقت الذي إشارة الفلورسنت تصل إلى عتبة معينة (أي عتبة دورة، أو C T).
<p class="jove_content"> لأن الوقت الحقيقي QPCR يتطلب معدات باهظة الثمن وركوب الدراجات الحرارية وعدة ساعات لتلقي نتائج، وتقنيات التضخيم متساوي الحرارة البديلة، مثل recombinase البلمرة (RPA)، وقد وضعت 4. توفر هذه المنصات عموما النتائج بشكل أسرع وتضخيم الأحماض النووية في الدنيا، ودرجة الحرارة واحدة، والتي يمكن إنجازها بأقل تكلفة، والمعدات أبسط. يتطلب الجيش الوطني الرواندي، والتي هي جاذبية خاصة لنقطة من الرعاية التطبيقات، وتضخيم DNA في دقائق، ودرجة حرارة منخفضة التضخيم (37 ° C)، ويبقى نشطا في وجود الشوائب 5،6. وقد وضعت المقايسات الجيش الوطني الرواندي لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك تحليل المواد الغذائية، والكشف عن العوامل المسببة للأمراض وسرطان فحص المخدرات، وكشف عن وكلاء biothreat 7-12. ومع ذلك، واستخدام الجيش الوطني الرواندي لتقدير الأحماض النووية كان محدودا 13،14.في الأعمال السابقة، كان SHOسفل ذلك الوقت الحقيقي الجيش الوطني الرواندي الكمي (qRPA) هو ممكن عمليا 15. هنا، يتم توفير بروتوكول أكثر تفصيلا لاستخدام الوقت الحقيقي الكمي الجيش الوطني الرواندي لتحديد العينات المجهولة باستخدام منحنى قياسي، وهو الأسلوب الذي مماثلة لالكمي باستخدام QPCR. يصف هذا البروتوكول كيفية تنفيذ رد فعل الجيش الوطني الرواندي على cycler الحرارية للكشف عن HIV-1 الحمض النووي كدليل صحة مفهوم، وكذلك كيفية وضع مراقبة إيجابية الداخلية (IPC) لضمان أن النظام يعمل بشكل صحيح. هو مفصل أيضا جمع البيانات باستخدام cycler الحرارية أو المجهر وتحليل البيانات لبناء منحنى قياسي باستخدام بيانات التدريب. وأخيرا، أثبتت طريقة لقياس العينات المجهولة باستخدام منحنى القياسية مع سيناريو مخصص. هذه التقنية تمكن qRPA الكمي للعينات مع تركيزات معروفة ولها مزايا عديدة أكثر من الوقت الحقيقي التقليدي QPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل الحصول على بيانات القياس الكمي ذات معنى باستخدام الخوارزمية MATLAB، يجب على المستخدم تحديد قيم المدخلات المناسبة عند المطالبة. بعد بدء كل النصي في القسمين 5 و 6، والتمست كل المتغيرات الإدخال تلقائيا في إطار الأوامر ولدت مخرجات تلقائيا. في القسم 5.7 تتم مطالبة المست…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من خلال منحة من مؤسسة بيل وميليندا غيتس من خلال التحديات الكبرى في مبادرة الصحة العالمية.
Materials
| qRPA Assay | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Software | Vendor | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
References
- Yoon, J. -. Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
- Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
- Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a., Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
- Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).
- Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
- Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).
- Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
- Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
- Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642 (2013).
- Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).
- Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).
- Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
- Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
- Sollis, K. a., et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869 (2014).
- . . Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , 1-166 (2011).
