एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के साथ एक मात्रात्मक recombinase पोलीमरेज़ प्रवर्धन परख के विकास
Summary
Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
Abstract
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Introduction
मात्रात्मक न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन पर्यावरण, खाद्य जनित, और जल जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए और साथ ही नैदानिक निदान के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) एचआईवी -1 वायरल लोड परीक्षण, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों का पता लगाने, और कई अन्य जीवों 1 के लिए स्क्रीनिंग के लिए जैसे न्यूक्लिक एसिड, की, संवेदनशील विशिष्ट, और मात्रात्मक का पता लगाने के लिए स्वर्ण मानक तरीका है – 3। वास्तविक समय qPCR के दौरान, प्राइमरों चक्र में रोगजनक डीएनए बढ़ाना, और एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रत्येक चक्र में नमूने में परिलक्षित डीएनए की राशि के लिए आनुपातिक है कि उत्पन्न होता है। रोगजनक डीएनए के एक अज्ञात एकाग्रता युक्त एक नमूना मानक नमूनों की प्रारंभिक डीएनए एकाग्रता और फ्लोरोसेंट संकेत एक निश्चित सीमा तक पहुँच जाता है, जिस पर समय (यानी, चक्र दहलीज, या सी टी) से संबंधित है कि एक मानक वक्र का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।
<p class="वास्तविक" समय qpcr के ऐसे recombinase पोलीमर्स प्रवर्धन (जन प्रतिनिधि कानून) रूप में परिणाम है, वैकल्पिक इज़ोटेर्माल तकनीक, प्राप्त करने लिए महंगा थर्मल साइकिल उपकरण और कई घंटे की आवश्यकता है क्योंकि "jove_content">, 4 विकसित किया गया है। इन प्लेटफार्मों आम तौर पर तेजी से परिणाम उपलब्ध कराने और कम खर्चीला है, सरल उपकरणों के साथ पूरा किया जा सकता है, जो एक कम, एकल तापमान, पर न्यूक्लिक एसिड बढ़ाना। , बिंदु का ध्यान अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से आकर्षक है मिनट में डीएनए amplifies जो जन प्रतिनिधि कानून, एक कम प्रवर्धन तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) की आवश्यकता है, और दोष 5,6 की उपस्थिति में सक्रिय रहता है। 12 – जन प्रतिनिधि कानून assays के biothreat एजेंटों 7 के खाद्य विश्लेषण, रोगज़नक़ का पता लगाने, कैंसर की दवा स्क्रीनिंग, और पता लगाने सहित आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का ठहराव के लिए जन प्रतिनिधि कानून के उपयोग 13,14 सीमित किया गया है।पिछले काम में, यह थानेदार थाWN कि वास्तविक समय मात्रात्मक जन प्रतिनिधि कानून (qRPA) 15 संभव है। इधर, एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल एक मानक वक्र, qPCR का उपयोग कर मात्रा का ठहराव के अनुरूप है कि एक विधि का उपयोग कर अज्ञात नमूने यों के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक जन प्रतिनिधि कानून का उपयोग करने के लिए प्रदान की जाती है। इस प्रोटोकॉल ठीक से कार्य कर रहा है प्रणाली सुनिश्चित करने के लिए एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) विकसित करने के लिए, साथ ही साथ एक सबूत की अवधारणा के रूप में एचआईवी -1 डीएनए का पता लगाने के लिए एक थर्मल cycler पर एक जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें। प्रशिक्षण डेटा का उपयोग कर एक मानक वक्र के निर्माण के लिए एक थर्मल cycler या माइक्रोस्कोप और डेटा विश्लेषण का उपयोग कर डेटा संग्रह भी विस्तृत है। अंत में, एक कस्टम स्क्रिप्ट के साथ मानक वक्र का उपयोग अज्ञात नमूने बढ़ाता के लिए विधि का प्रदर्शन किया जाता है। इस qRPA तकनीक अज्ञात सांद्रता के साथ नमूनों की मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता है और पारंपरिक वास्तविक समय qPCR पर कई फायदे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जब प्रेरित MATLAB के कलन विधि का उपयोग सार्थक मात्रा का ठहराव डेटा प्राप्त करने के क्रम में, उपयोगकर्ता उपयुक्त इनपुट मूल्यों का चयन करना होगा। धारा 5 और 6 में प्रत्येक स्क्रिप्ट की शुरुआत के बाद, सभी इनपुट ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध वैश्विक स्वास्थ्य पहल में ग्रांड चुनौतियों के माध्यम से बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Materials
| qRPA Assay | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Software | Vendor | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
References
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