Развитие количественной рекомбиназу полимеразной амплификации с внутреннего положительного контроля
Summary
Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
Abstract
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Introduction
Количественный амплификации нуклеиновых кислот является важным методом для обнаружения окружающей среды, пищевого происхождения, и водно-патогенных микроорганизмов, а также для клинической диагностики. В режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) является метод золотой стандарт для чувствительной, конкретной и количественного определения нуклеиновых кислот, например, для ВИЧ-1 вирусной нагрузки испытаний, обнаружение бактериальных патогенов, и скрининг на многих других организмов 1 – 3. В режиме реального времени кПЦР, праймеры амплификации ДНК патогена в циклах, и флуоресцентный сигнал, который пропорционален количеству амплифицированной ДНК в образце при каждом цикле. Образец, содержащий неизвестное концентрации патогенов ДНК может быть определена количественно с использованием стандартной кривой, которая относится к начальной концентрации ДНК стандартных образцов и времени, при котором флуоресцентный сигнал достигает определенного порога (т.е. порогового цикла, или С Т).
<p class="Jove_content"> Поскольку в режиме реального времени КПЦР требует дорогостоящего оборудования термоциклировании и несколько часов, чтобы получить результаты, альтернативные изотермические методы амплификации, такие как рекомбиназа полимеразной амплификации (РПА), были разработаны четыре. Эти платформы обычно обеспечивают результаты быстрее и амплификации нуклеиновых кислот при более низкой температуре, одной, которая может быть выполнена с менее дорогой, простой оборудования. РПА, которое является особенно привлекательным для точка-в-ухода приложений, усиливает ДНК в минутах, требуется более низкая температура амплификации (37 ° С), и остается активным в присутствии примесей 5,6. РПА анализы были разработаны для широкого спектра применений, в том числе анализа пищевых продуктов, обнаружения возбудителя, рак скрининга лекарственных средств, и выявления biothreat агентов 7 – 12. Тем не менее, использование РПА для количественного определения нуклеиновых кислот была ограничена 13,14.В предыдущей работе, это было шоWn, что в режиме реального времени количественный РПА (QRPA) возможна 15. Здесь более подробно протокол предназначен для использования в режиме реального времени количественный RPA количественно неизвестных образцов с использованием стандартной кривой, способ, аналогичный количественного использованием КПЦР. Этот протокол описывает, как выполнить реакцию РПА термоциклере для обнаружения ДНК ВИЧ-1, как доказательство правильности концепции, а также о том, как развивать внутренний положительный контроль (IPC), чтобы убедиться, что система функционирует нормально. Сбор данных с использованием амплификатор или микроскопа и анализа данных для построения стандартной кривой с использованием обучающих данных также подробно. Наконец, метод количественного неизвестных образцов, используя калибровочную кривую с помощью специального сценария показано. Этот метод дает количественное QRPA образцов с неизвестными концентрациями и имеет много преимуществ по сравнению с традиционными реального времени кПЦР.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того, чтобы получить значимые данные количественной с использованием алгоритма MATLAB, пользователь должен выбрать соответствующие значения входного сигнала, когда будет предложено. После начала каждого сценария в разделах 5 и 6, все входные переменные автоматически запросил в окне ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано за счет гранта от Фонда Билла и Мелинды Гейтс через Великие задачи в Глобальной инициативы в области здравоохранения.
Materials
| qRPA Assay | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Software | Vendor | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
References
- Yoon, J. -. Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
- Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
- Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a., Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
- Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).
- Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
- Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).
- Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
- Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
- Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642 (2013).
- Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).
- Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).
- Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
- Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
- Sollis, K. a., et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869 (2014).
- . . Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , 1-166 (2011).
