내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

Summary

Provided는 열 순환기 또는 현미경 및 스테이지 히터를 사용하여 DNA 샘플의 초기 농도를 정량화하기 위한 실시간 재조합효소 중합효소 증폭 분석을 개발하기 위한 프로토콜입니다. 또한 내부 양성 대조군의 개발도 설명되어 있습니다. 원시 실시간 형광 데이터를 처리하기 위한 스크립트가 제공됩니다.

Abstract

병원체 검출을 위한 등온 증폭 플랫폼인 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)을 사용하여 표준 곡선을 사용하여 DNA 샘플 농도를 정량화할 수 있음이 최근에 입증되었습니다. 이 원고에서는 실시간 정량적 재조합효소 중합효소 증폭 분석(qRPA 분석)을 개발하고 구현하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. HIV-1 DNA 정량화를 예로 들어 실시간 RPA 반응 조립, IPC(Internal Positive Control) 염기서열 설계, IPC와 관심 대상의 동시 증폭에 대해 모두 설명합니다. 여러 실험의 데이터를 사용하여 표준 곡선을 구성하기 위한 지침 및 데이터 처리 스크립트가 제공되며, 이는 미지 샘플의 농도를 예측하거나 분석의 성능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 현장 진료 qRPA 분석을 개발하기 위한 단계로 현미경과 스테이지 히터를 사용하여 실시간 형광 데이터를 수집하는 대체 방법에 대해 설명합니다. 제공된 프로토콜 및 스크립트는 관심 DNA 표적에 대한 qRPA 분석 개발에 사용할 수 있습니다.

Introduction

정량적 핵산 증폭 환경, 인성 및 인성 병원균의 검출뿐만 아니라, 임상 적 진단을위한 중요한 기술이다. 실시간 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)는 HIV-1 바이러스 성 부하 테스트 세균성 병원체의 검출 및 다른 많은 생물 ^한 스크리닝 예를 들면 핵산의 민감하고 특이 및 정량적 검출 금 표준 방법 ^{- 3.} 실시간 qPCR의 동안 프라이머 사이클 병원체 DNA를 증폭 및 형광 신호는 각주기에서 증폭 된 DNA 시료의 양에 비례한다고 생성된다. 병원체 DNA의 미지 농도를 함유하는 샘플은 표준 시료의 초기 DNA 농도와 형광 신호가 특정 임계 값에 도달하는 시간 (즉, 사이클 임계치 또는 C의 _T)에 관한 표준 곡선을 사용하여 정량화 될 수있다.

^4, 개발되어왔다. 이러한 플랫폼은 일반적으로 더 빠른 결과를 제공하고 덜 비싼, 간단한 장치로 달성 될 수있는 저급 단일 온도에서 핵산을 증폭. , 현장 진료 응용 프로그램에 특히 매력적인 분 안에 DNA를 증폭 RPA는 낮은....

Protocol

1. 프로그램 실시간 qRPA의 반응에 대한 열 자전거 타는 사람

1. 열 자전거 타는 소프트웨어의 새로운 프로토콜을 작성합니다.
   1. 1 분 39 ° C : 미리 배양 단계를 삽입합니다.
   2. 두 번째 단계를 추가 : 39 ° C를 판 읽기 다음 20 초 동안.
   3. 마지막으로, 두 번째 단계를 반복 59 번 "로 이동"삽입합니다.
   4. 프로토콜을 저장합니다.
2. 소프트웨어의 "판 편집기"탭에서 새 판을 만듭니다. RPA 반응의 위치에 해당하는 접시에 우물 선택합니다 (여기를 사용 우물 A1, A4-A8, B1 및 B4-B8).
   주 : 데이터 분석이 커스텀 스크립트를 사용하여 수행되는 것처럼 웰 (예를 들어, "표준", "NTC")의 샘플 유형이 지정되었는지 여부를 중요하지 않다.
   1. 만 HIV-1 DNA를 포함하는 실험의 경우, 모든 우물 "HEX"형광을 선택합니다. HIV-1 DNA와 내부 긍정적 인 협력을 포함하는 실험ntrol "HEX"모든 우물 용 "FAM"형광 물질을 모두 선택합니다. 접시를 저장합니다.

2. HIV-1 qRPA 실험 준비

1. qPC....

Results

목표 qRPA 실험에서 IPC 역할을하는 시퀀스를 선택하기 전에 (HIV-1) DNA, 내부 양성 대조군 (IPC) 후보가 생성되어 HIV-1 DNA가없는 상태 qRPA 반응으로 증폭 할 수있는 능력에 대한 검사. IPC 후보 타겟 (HIV-1)의 아웃 - 경쟁 HIV-1 앰플 리콘 형성에서 IPC 형성되지 않도록 DNA보다 길다. 도 2a, C.의 두 세대에 도시 된 바와 같이 IPC 포자충 후보들 겔 전기 영동을 사용하여 415 및 435 bp의 밴드의 존재에 의해 확인되었다. ¹⁰⁴ 및 ¹⁰⁵ 복제본의 합계 (도 2C) 존재시 이상 후보 증폭 동안 지속적 qRPA 반응에서, IPC 짧은 후보 작은 증폭 (도 2B)를 나타냈다. 따라서, 더 이상 후보는 HIV-1 qRPA 실험에 대한 IPC로 선정되었다.

실시간.......

Discussion

프롬프트되면 MATLAB 알고리즘을 사용하여 의미있는 정량화 된 데이터를 획득하기 위해, 사용자는 해당 입력 값을 선택한다. 제 5,6의 각 스크립트를 개시 한 후, 모든 입력 변수는 자동 명령 창에서 요청 된 것으로 출력이 자동으로 생성된다. 5.7 절에서는 사용자가 기울기 임계 값을 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 경사의 문턱 값은 착용감 상관 계수 (R ^2)의 제곱에 영향을 미친다. 열 사이 클러에서 반출 형광 원시 데이터를 사용하는 경우, 2.0와 5.0 사이의 값은 높은 계수 R ^2를 수득하는 경향이있다. 5.8 절에 사용자가 긍정적 인 임계 값을 설정하는 배경 위로 표준 편차의 수를 지정해야한다. 양 또는 음으로 샘플을 점수로 스크립트가 자동으로 화력에서 내 보낸 원시 형광 데이터를 사용하여 각 샘플에 대한 최대 및 최소 형광 사이의 차이 Δ _샘플을 결정한다L 자전거 타는 사람. 그것은 모든없는 목표 제어 샘플의 평균 차이 Δ _배경 및 표.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA 분석
HIV-1 포워드 프라이머	통합 DNA 기술	맞춤형 DNA 올리고	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'
HIV-1 리버스 프라이머	통합 DNA 기술	맞춤형 DNA 올리고	5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3'
HIV-1 프로브	BioSearch Technologies	맞춤형 DNA 올리고:	5'- TGC, TAT, TAT, GTC, TAC, TAT, TCT, TTC, CCC, [SIMA/HEX], GC, [THF], C, [dT-BHQ1], GTA, CCC, CCC, AAT, CCC, CC, C, -3'
IPC 프로브	BioSearch Technologies	주문 DNA 올리고	5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
RPA 엑소 시약 (펠릿, 수분 보충 버퍼, 마그네슘 아세테이트	TwistDx	TwistAmp 엑소
PCR 튜브 스트립	BioRad	TLS0801
PCR 플랫 캡 튜브 스트립	BioRad	TCS0803
마이크로 밀봉 접착제	BioRad	558/MJ
HIV-1 표적(pHIV-IRES- eYFPΔ 환경&델타; 비프&델타; Vpr)			사용자 정의 플라스미드, 참조: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. 변경된 숙주 범위의 인공 복제 역량 렌티바이러스의 특성화 및 검출. 분자 치료 8, 118– 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
인간 남성 게놈 DNA	응용 바이오 시스템	360486
96 웰 콜드 블록	콜 파머	EW-36700-48
열 순환기	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris 버퍼 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	사용자가 C. parvum (BSL-2 감염원)을 사용할 준비가 되어 있지 않은 경우 IDT에서 이중 가닥 합성 타겟을 주문할 수도 있습니다. C. parvum에 대한 PCR 및 RPA 프라이머는 GenBank 등록 번호 AF115377.1
PCR long forward 프라이머를	Integrated DNA Technologies	맞춤형 DNA 올리고	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'
PCR 긴 반전 뇌관	Integrated DNA Technologies	주문 DNA 올리고	5' - CCC, GAA, AAT, TTT, GAA, TTT, TTG, TAA, TTT, GTT, TTT, G/TGC, TGG, AGT, ATT, CAA, GGC, ATA, -3'
Phusion High-Fidelty DNA 중합효소	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick 겔 추출 키트	Qiagen	28704
TAE 10X 버퍼	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
현미경 실험
직립 형광 현미경	Zeiss	Zeiss Imager.J1
스테이지 히터	Bioscience Tools	TC-GSH
1-채널 정밀 고안정성 온도 컨트롤러	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP 필터 큐브	Zeiss	필터 세트 38 (000000-1031-346)	여기 BP 470/40 nm, 방출 BP 520/50 nm
HEX 필터 큐브	Chroma	49014	여기 BP 530/30 nm, 방출 BP 575/40 nm
레이저 커터	조각사의 네트워크	VLS3.60
1/8" 블랙 아크릴	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm 투명 아크릴	McMaster Carr	PD-72268940
슈퍼 글루	Office Depot	Duro 슈퍼 글루
PCR 등급 미네랄 오일	시그마 Aldrich	M8662-5VL
데이터 분석
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB MATLAB 스크립트: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"	SI
됨: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"	SI
됨: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"	SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	SI
JoVE_qRPA_base.ai	에 포함됨 SI
AxioVision 소프트웨어	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	SI