This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Multimodal, imagiologia molecular permite a visualização de processos biológicos em resoluções celulares, subcelulares, e em nível molecular, utilizando várias técnicas de imagem, complementares. Esses agentes de imagiologia facilitar a avaliação em tempo real das vias e mecanismos in vivo, o que aumenta tanto a eficácia de diagnóstico e terapêutico. Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) – uma nova classe de agentes para a utilização em aplicações de imagem molecular multimodais. As modalidades de imagem incorporados no nanopartículas, imagens de fluorescência e imagem por ressonância magnética (MRI), têm características complementares. As NPs PB possui um desenho de núcleo-invólucro que o gadolínio e iões de manganês incorporados dentro dos espaços intersticiais do retículo PB gerar contraste para IRM, tanto em T 1 e T 2 sequências ponderadas. Os PB NPs são revestidas com avidina fluorescente usando eletrostática auto-comotagem, o que permite imagens de fluorescência. As nanopartículas revestidas com avidina são modificados com ligandos biotinilados que conferem capacidades de segmentação moleculares para as nanopartículas. A estabilidade e a toxicidade das nanopartículas são medidos, bem como os seus relaxividades MRI. Os recursos de imagens multimodais, moleculares destas PB NPs bioativa são então demonstrada, utilizando-os para imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular in vitro.
A imagem molecular é a visualização não invasiva e direcionada de processos biológicos no celular, subcelular e níveis moleculares 1. A imagem molecular permite um espécime a permanecer no seu microambiente nativa, enquanto as suas vias e mecanismos endógenos são avaliados em tempo real. Tipicamente, imagiologia molecular envolve a administração de um agente de imagiologia exógeno sob a forma de uma molécula pequena, macromolécula, ou nanopartículas para visualizar, alvo, e rastrear processos fisiológicos relevantes serem estudados 2. As diversas modalidades de imagem que foram exploradas em imagem molecular incluem MRI, CT, PET, SPECT, ultra-som, photoacoustics, espectroscopia Raman, bioluminescência, fluorescência e microscopia intravital 3. Imagiologia multimodal é a combinação de dois ou mais modalidades de imagem em que a combinação aumenta a capacidade de visualizar e caracterizar vários processos e eventos biológicos 4. Multimodal imaging explora os pontos fortes das técnicas de imagem individuais, enquanto compensar suas limitações individuais 3.
Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) – uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares. Os PB NPs são utilizados para geração de imagens de fluorescência e MRI molecular. OP é um pigmento que consiste de ferro (II) e (III) átomos de ferro alterno numa rede cúbica de face centrada (Figura 1). A estrutura é composta de PB ligandos lineares de cianeto de uma liga de Fe II – CN – Fe III ligação que incorpora catiões para equilibrar cargas da sua rede tridimensional 5. A capacidade de PB para incorporar cátions em sua estrutura é explorada por carregar separadamente gadolínio e manganês nas NPs PB para o contraste de ressonância magnética.
A justificativa para perseguir um projeto de nanopartículas para o contraste MRI é por causa deas vantagens deste projeto oferece em relação a agentes de contraste MRI atuais. A grande maioria dos agentes de contraste de MRI e aprovado pelo FDA dos EUA são o gadolínio que são paramagnética na natureza e oferecem contraste positivo pelo spin-estrutura mecanismo de relaxamento 6,7,8. Em comparação com um único gadolínio-quelato que proporciona uma baixa intensidade de sinal por si só, a incorporação de vários iões gadolínio dentro da estrutura PB das nanopartículas proporciona uma maior intensidade de sinal (contraste positivo) 3,9. Além disso, a presença de vários iões gadolínio dentro da rede PB aumenta a densidade geral de rotação e a magnitude do paramagnetismo das nanoparticulas, o que perturba o campo magnético local na sua vizinhança, gerando assim contraste negativo pelo mecanismo de relaxação spin-spin. Assim, as nanopartículas contendo gadolínio funcionar tanto como um T (positivo) e T 2 (agentes de contraste negativo) 10,11.
Num subgrupo de pacientes com insuficiência renal, a administração de agentes de contraste à base de gadolínio tem sido associada ao desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica 8,12, 13. Esta observação levou a investigações sobre a utilização de iões paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por conseguinte, o desenho versátil das nanopartículas está adaptado para incorporar os iões de manganês dentro da rede PB. Semelhante a quelatos de gadolínio, manganês quelatos também são paramagnéticos e são normalmente utilizados para proporcionar a intensidade de sinal positivo em MRI 7,14. Tal como acontece com gadolínicos PB PN, os contendo manganês PB PN também funcionar como um T (positivo) e T 2, os agentes de contraste (negativo).
Para incorporar capacidades de imagem de fluorescência, as nanopartículas "núcleos" são revestidas com um invólucro "biofuncional" consistindo de avidina marcada fluorescentemente-glicoproteína (Figura 1). Avidina não apenas permite imagens de fluorescência, mas também serve como uma plataforma de acoplagem para ligandos biotinilados que alvejam as células e tecidos específicos. A ligação de avidina-biotina é uma das mais fortes conhecidas, ligações não-covalentes caracterizados por afinidade de ligação extremamente forte entre a avidina e a biotina 15. A fixação de ligantes bioestanhados ao revestida com avidina PB NPs confere capacidades de segmentação moleculares para os PN PB.
A motivação para a prossecução de fluorescência e imagem latente usando PB NPs é porque estas modalidades de imagem possuem características complementares. Imagens de fluorescência é uma das técnicas de imagem molecular ópticos mais utilizado, e permite a visualização simultânea de vários objetos em altas sensibilidades 1,16,17. Imagens de fluorescência é um cofre, modalidade não-invasivo, mas está associada a baixos profundidades de penetração e resoluções espaciais 1,3,16. Por outro lado, a RM gera uma alta temporaisd resolução espacial de forma não invasiva e sem a necessidade de radiação ionizante 1,3,16. No entanto MRI sofre de baixa sensibilidade. Portanto imagens de fluorescência e RM foram selecionados como as técnicas de imagem molecular, devido às suas características complementares de penetração em profundidade, sensibilidade e resolução espacial.
Este artigo apresenta o protocolo para a síntese e biofunctionalization das NPs PB, PB PN (GdPB), e contendo gadolínio PB PN (MnPB) 10,11 contendo manganês. Os seguintes métodos são descritos: 1) de medição de tamanho, carga, e estabilidade temporal das nanopartículas, 2) avaliação da citotoxicidade das nanopartículas, 3) de medição de relaxamentos MRI, e 4) a utilização de nanopartículas para fluorescência e ressonância magnética molecular de uma população de células alvo in vitro. Estes resultados demonstram o potencial dos PN para utilização como agentes de imagem moleculares multimodais, in vivo.
Este artigo apresentou os métodos para a síntese de uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares baseados em nanopartículas bioativa de azul da Prússia. As modalidades de imagem molecular incorporados nas nanopartículas são imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular, devido às suas características complementares. As nanopartículas azuis cobalto bioativa de ter um design core-shell. As principais etapas da síntese destas nanopartículas são: 1) one-pot síntese, que dá os n…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
Sonicator | QSonica | Q125 | |
Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
Tube holders | VWR | 82024-342 | |
Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
100 mL round-bottom flask |