Lepr<sup> Db</sup> עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
סוכרת מסוג 2 היא מחלה כרונית המשפיעה על 382 מיליון אנשים בשנת 2013, והוא צפוי לעלות ל 592 מיליון על ידי 2035 1. במהלך 2 העשורים האחרונים, את התפקיד של בעיות בתפקוד התא בטא בסוכרת מהסוג 2 כבר נקבע 2 באופן ברור. התקדמות מחקר נדרשת שיטות לבידוד של איי לבלב. הפרוטוקול של בידוד איון מוצג כאן מניות רבות צעדים משותפים עם פרוטוקולים מקבוצות אחרות, עם כמה שינויים כדי לשפר את התפוקה ואיכות של איים מבודדים משני הסוג בר וdb Lepr סוכרת עכברים (DB / DB). שיטת הדמיה 2-פוטון לחיות תאים מכן הציגה שיכול לשמש כדי לחקור את השליטה בהפרשת אינסולין באיים.
Introduction
התפקיד של תפקוד לקוי של בטא-תא במחלה הוכר נרחב 3,4. שורות תאים כגון MIN6 ואח"י-1 הן כלים שימושיים כדי להבין את הביולוגיה של תאי הבטא התנהגות. עם זאת, השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין מתרחשת בתוך האיים לנגרהנס. איים אלה מכילים אלפי תאי הבטא צפופים, כמו גם כלי דם וסוגי תאים אנדוקריניות אחרים. סביבה זו באיון משפיעה הפרשת אינסולין ועשויה להיות חשוב בסוכרת. לכן, כדי להבין את השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין, והפתופיזיולוגיה של מחלה, חשוב ללמוד איים שלמים.
בידוד איון
איים חיים אדם ו, באיים מסוימים, אדם מחולי סוכרת מסוג 2 הם קשים להשגה. בנוסף, יש לי איים אנושיים אפשרויות מוגבלות למניפולציה מולקולרית ניסיונית. חוקרים לכן מועסקים הואמאפשר מבעלי חיים ומודלים של בעלי חיים של סוכרת מהסוג 2. מודל מחלה אחת כזו הוא עכבר db / db. זוהי מוטציה ספונטנית שמודלי סוכרת מסוג 2 עם התקדמות הפנוטיפ שמקבילה מחלה אנושית 5,6 מקרוב. יש הפרוטוקול המובא כאן לבידוד איון מעכברי db / db סוכרת שלבים רבים במשותף עם קבוצות אחרות עם כמה חידודים לתשואה טובה יותר, טיהור והישרדות איון משופרת.
הדמיה 2 פוטון
Assay 2-הפוטון לחיות התאים המתוארים כאן מאפשר לחוקרים לכמת את המספר ולהעריך את המאפיינים של גרגרים המכיל אינסולין אחת מהתאים רבים של 7 סוכרת והסוג בר על האיים קטנטנים 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגורם הקריטי ביותר בבידוד איון הוא זלוף הראשוני של הלבלב; תחת perfused תוצאות לבלב בתשואת איון נמוך משמעותי. גורמים אחרים משפיעים גם על איכות הבידוד כגון זמן העיכול והרמה של טלטול שיכול לפצות באופן חלקי לרמה של זלוף. לדוגמא, לבלב perfused באופן מלא יהיה צורך טופח על 37 מעלו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
