मॉडल फली में जल्दी भ्रूण के विकास के नियमन के अध्ययन के लिए युग्मज और दैहिक भ्रूणों प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
एक एकल कोशिका युग्मनज से शुरू जल्दी embryogenesis तेजी से कोशिका विभाजन और morphogenesis के माध्यम से चला जाता है, और आकृति विज्ञान के पूर्व गोलाकार, गोलाकार, हृदय, टारपीडो और अंकुर चरणों की विशेषता है। यह क्रमिक विकास एक जटिल आणविक नेटवर्क की तंग विनियमन के अधीन है। विकास के एक समान स्तर पर पर्याप्त जल्दी भ्रूण कटाई जल्दी embryogenesis के सेलुलर और आणविक विनियमन की जांच के लिए आवश्यक है। Medicago के लिए उदाहरण के 8 दिन जल्दी अंकुर चरण तक पहुंचने के लिए truncatula जबकि जल्दी embryogenesis एक संक्षेप में तेजी morphogenesis से होकर गुजरती है के बाद से यह स्पष्ट नहीं है। यहाँ, हम दोनों के दृष्टिकोण से मुद्दे के समाधान। पहले एक युग्मज भ्रूण के मंच से संकेत मिलता है की मदद करने में भ्रूण के विकास और फली आकृति विज्ञान के बीच एक संबंध स्थापित करता है। यह विशेष रूप से फली बढ़ता और कांटा के विकास की संख्या पर आधारित है। इन विवो के पूरक करने के लिए एक वैकल्पिक तरीकाtudies दैहिक भ्रूण का निर्माण करने के संवर्धन पत्ती explants के माध्यम से होता है। मध्यम एक असामान्य हार्मोन संयोजन शामिल है – एक auxin (1-naphthaleneacetic एसिड), एक cytokinin (6 benzylaminopurine), abscisic एसिड और gibberellic एसिड। विभिन्न चरणों विच्छेदन के बिना घट्टा के बाहर से बढ़ पहचाना जा सकता है।
Introduction
काटा क्षेत्र और कुल उत्पादन 1 में अनाज के लिए दूसरा फलियां लगभग 20,000 प्रजातियों और Leguminosae (या Fabaceae) परिवार के साथ उच्च पौधों का तीसरा सबसे बड़ा परिवार हैं। सोयाबीन की खेती की तीसरी सबसे बड़ी फसल है। अनाज फलियां आहार प्रोटीन का एक-तिहाई और मानव उपभोग के लिए 2 वनस्पति तेल का एक तिहाई के बारे में प्रदान करते हैं। उनके 2 एन फिक्सिंग क्षमता के साथ फलियां भी इसके बीज की बीजपत्र में सोयाबीन, दुकानों प्रोटीन और तेल की तरह,। टिकाऊ कृषि प्रणालियों को Medicago truncatula योगदान और काफी आनुवंशिक और जीनोमिक संसाधनों 3,4 के साथ एक आनुवंशिक और जीनोमिक फली मॉडल है। एम जबकि truncatula यह तेजी से फली के बीज जीव विज्ञान 5-7 और embryogenesis 8,9 अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है फली-र्हिज़ोबियम सहजीवन 4 को समझने के क्षेत्र में प्रगति के लिए सक्षम है। एराबिडोप्सिस embryogenesis के बड़े पैमाने पर 10,11 का अध्ययन किया, लेकिन यह मैं कर दिया गया हैSA गैर-फली और embryogenesis के विवरण Medicago 8,10 करने के लिए समान नहीं हैं। एम में युग्मज embryogenesis truncatula एक विशिष्ट बहुकोशिकीय hypophysis, एक endoployploid suspensor और बेसल स्थानांतरण सेल 8 के साथ, दिलचस्प सुविधाओं है।
दैहिक embryogenesis (एसई) आमतौर पर पौधों 12 regenerating के लिए प्रयोग किया जाता है। फली मॉडल एम में truncatula, माता पिता Jemalong से विकसित किया गया है बीज लाइन Jemalong 2HA (2HA) दैहिक embryogenesis 13 की उच्च दर है। उत्पादित भ्रूण की संख्या हाल ही में स्वतंत्र लंबे समय की स्थापना मध्यम से 14 दोनों gibberellic एसिड (जीए) और abscisic एसिड (ए.बी.ए.) जोड़कर बढ़ा दी गई है। जीए और ए.बी.ए. आमतौर पर विरोधी 14 में कार्य दिया है कि जो असामान्य है synergistically के इस मामले जीए और ए.बी.ए. अधिनियम में। घट्टा से उत्पादित भ्रूण embryogenesis के चरण आसानी से visuall निर्धारित करने की अनुमति देता है, जो सतह पर विकसितY और आसानी से काटा। दैहिक embryogenesis की जांच (Jemalong) (2HA) embryogenic और गैर embryogenic हैं कि isogenic लाइनों के पास की सुविधा होने और vivo में और विभिन्न प्रयोगात्मक संभावनाएं प्रदान करता है इन विट्रो प्रणालियों में दोनों कर रही है।
भ्रूण के विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना समझ बीज और संयंत्र के विकास के लिए आवश्यक है। फलियां में, अन्य dicotyledons में के रूप में, यह मानव पोषण के लिए उपयोग किया जाता है कि उत्पादों की दुकान है कि भ्रूण के बीजपत्र है। जल्दी embryogenesis तेजी से कोशिका विभाजन, और सही भ्रूण patterning के शामिल है। लगभग 8 दिनों के निषेचन के बाद, एम में truncatula भ्रूण जल्दी अंकुर चरणों तक पहुँचता है। रूपात्मक लक्षण वर्णन बिल्कुल Glasshouse परिस्थितियों में निषेचन के बाद दिन के द्वारा संकेत नहीं है। इस प्रकार, विकासशील भ्रूण के मंच से संकेत मिलता है एक कुशल मानकीकृत दृष्टिकोण आनुवंशिक regul का अध्ययन करने में मूल्यवान हैजल्दी युग्मज embryogenesis की समझना।
इस पत्र में, हम फली मॉडल एम में embryogenesis के जैविक अध्ययन के लिए विकासशील भ्रूण एकत्र करने के लिए दो मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान truncatula। पहले एक दूसरे को आसानी से पहुँचा बड़े भ्रूण संख्या प्रदान करने के लिए संवर्धन पत्ती explants के माध्यम से दैहिक embryogenesis है, जबकि embryogenesis और फली आकृति विज्ञान जोड़ से युग्मज भ्रूण एकत्र करने के लिए है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सीधे आगे रहे हैं और सभी समकालीन सेल और आणविक तकनीक के साथ फली embryogenesis की जांच की अनुमति देते हैं। हम फायदे और vivo में इन विट्रो दृष्टिकोण में दोनों का नुकसान कर रहे हैं कि …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula – implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
