Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
Embriogenesi precoce a partire da una singola cellula zigote attraversa rapida divisione cellulare e la morfogenesi, ed è morfologicamente caratterizzato da fasi di pre-globulare, globulari, cuore, siluri e cotyledon. Questo progressivo sviluppo è sotto la stretta regolazione di una rete molecolare complessa. Raccolta sufficienti embrioni in uno stadio di sviluppo è essenziale per studiare la regolazione cellulare e molecolare del primo embriogenesi. Questo non è semplice da inizio embriogenesi subisce una rapida morfogenesi in breve tempo ad esempio, 8 giorni per i Medicago truncatula per raggiungere la fase cotyledon precoce. Qui, affrontiamo il problema da due approcci. Il primo stabilisce un legame tra lo sviluppo embrionale e pod morfologia nell'aiutare indica la fase dell'embrione zigotico. Questo è particolarmente basa sul numero di spirali pod e sviluppo delle spine. Un modo alternativo per integrare in vivo sTUDI è via espianti fogliari coltura per la produzione di embrioni somatici. Il supporto include una combinazione di ormoni insolito – un'auxina (acido 1-naftalenacetico), un citochinine (6-benzilaminopurina), acido abscissico e acido gibberellico. Le diverse fasi possono essere individuate a crescere senza il callo senza dissezione.
Introduction
I legumi sono la terza più grande famiglia di piante superiori con circa 20.000 specie e la (o Fabaceae) famiglia delle leguminose sono secondi a cereali in superficie coltivata e produzione totale 1. La soia è la terza più grande coltivato. Legumi granella forniscono circa un terzo delle proteine alimentari e un terzo di olio vegetale per il consumo umano 2. Legumi con la loro capacità di fissaggio N 2 contribuiscono a sistemi agricoli sostenibili. Medicago truncatula, come la soia, i negozi di proteine e olio nelle cotiledoni di suoi semi ed è un modello di legume genetica e genomica, con notevoli risorse genetiche e genomiche 3,4. Mentre M. truncatula ha consentito progressi nella comprensione del legume-rhizobium simbiosi 4 è stato sempre impiegato per studiare sementi di leguminose biologia 5-7 e embriogenesi 8,9. Arabidopsis embriogenesi è stato ampiamente studiato 10,11 ma isa non legume ei dettagli dell'embriogenesi non sono identici a Medicago 8,10. Zigotica in M. truncatula ha caratteristiche interessanti, con un ipofisi multicellulare distintivo, un suspensor endoployploid e cellule basali trasferimento 8.
Embriogenesi somatica (SE) è comunemente utilizzato per la rigenerazione piante 12. Nel modello legume M. truncatula, la linea seme Jemalong 2HA (2HA) è stato sviluppato dal genitore Jemalong di avere alti tassi di embriogenesi somatica 13. Il numero di embrioni prodotti è stata recentemente sostanzialmente aumentato aggiungendo sia l'acido gibberellico (GA) e l'acido abscissico (ABA) al mezzo di lunga data 14. In questo caso, GA e ABA agiscono in sinergia, che è inusuale visto che GA e ABA di solito agiscono antagonisticamente 14. Gli embrioni ottenuti da callo sviluppano sulla superficie che permette la fase dell'embriogenesi per essere facilmente determinata Visually e prontamente raccolto. Avendo in prossimità di linee isogeniche che sono embryogenic (2HA) e non-embriogenetica (Jemalong) facilita l'indagine di embriogenesi somatica e avendo sia in vivo che in vitro sistemi fornisce diverse possibilità sperimentali.
La comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo embrionale è essenziale per le sementi di comprensione e lo sviluppo delle piante. In legumi, come in altre dicotiledoni, sono i cotiledoni dell'embrione che immagazzinare i prodotti che vengono utilizzati per l'alimentazione umana. Embriogenesi precoce coinvolge rapida divisione cellulare, e corretta patterning dell'embrione. In circa 8 giorni dopo la fecondazione, la M. truncatula embrione raggiunge stadi cotyledon iniziali. La caratterizzazione morfologica non è esattamente indicato da giorni dopo la fecondazione in condizioni serra. Così, un approccio standardizzato efficace per indicare la fase di embrioni in via di sviluppo è prezioso per lo studio della genetica regulzione del primo zigotica.
In questo lavoro, mettiamo a disposizione due protocolli standardizzati per raccogliere embrioni in via di sviluppo per gli studi biologici della embriogenesi nel modello legume M. truncatula. Il primo è quello di raccogliere gli embrioni zigotici associando embriogenesi e pod morfologia mentre il secondo è embriogenesi somatica via espianti fogliari coltura di fornire un gran numero di embrioni facilmente accessibili.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli descritti sono relativamente semplice e permettono indagini dell'embriogenesi legume con tutta la cellula contemporanea e tecniche molecolari. Si riconosce che ci sono vantaggi e svantaggi di entrambi in vivo e in vitro approcci. Entrambi permettono maggiore attenzione per embriogenesi precoce rispetto alla cultura dei semi immaturi 19.
Nel caso di studi in vivo quanto descritto è prevalentemente l'isolamento dell'ovulo dal bacc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
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