التصوير تستقيم من<em> ذبابة الفاكهة</em> غرف البيض
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
وقد وفرت دراسة ذبابة الفاكهة البطن رؤى كبيرة في التنظيم الجيني للمجموعة واسعة من الظواهر. على وجه الخصوص، لم يكن هناك بحوث واسعة النطاق على التنمية البيض، لأن مراحل تكوين البويضات يوفر طريقة الانقياد للتحقيق في العديد من العمليات التنموية المختلفة، بما في ذلك الزخرفة الأنسجة، والتغيرات قطبية الخلية، دورة الخلية التبديل، وتنظيم متعدية 1،2،3،4. حدث واحد morphogenic المهم خلال مراحل تكوين البويضات هي مواصفات، اكتساب القدرة على الحركة، والهجرة من مجموعة من الخلايا تسمى خلايا الحدود (استعراضها في 5). منذ الهجرة الخلية هو سمة أساسية من سمات التشكل الحيوان، ولأن التنظيم الجيني لهذه العملية يتم حفظها جيدا، وآليات تحدد في الذباب من المحتمل أن تكون مهمة في سياقات أخرى. وبالتالي، نحن نحقق في السيطرة الجزيئية للهجرة الخلايا الحدود. لدراساتنا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لمراقبة القطبين الأمامية تطوير البيض،حيث تنشأ خلايا الحدود، لدراسة كيفية تطوير بالتفصيل.
داخل المبيض، وتوجد غرف البيض في مراحل النمو المختلفة على امتداد سلاسل دعا ovarioles، والتي المغطى في غمد رقيقة (الشكل 1A). وسيكون لكل غرفة البيض على المضي قدما لتشكيل بيضة واحدة. خلال مراحل تكوين البويضات، يجب عدة أنواع مختلفة من الخلايا تتطور بطريقة منسقة. وD. وتتكون غرفة البطن البيض من 16 خلايا خط الجرثومية، بما في ذلك بويضة واحدة، وتحيط بها طبقة واحدة ظهارة مسامي 6. تنشأ هناك عدد صغير من الخلايا المتخصصة، تسمى خلايا القطبية، في الأمامي والخلفي أقطاب ظهارة. الخلايا الحدود 6-8 تنشأ في الظهارة الأمامية للغرفة البيض، والناجمة عن الخلايا القطبية 5،7. في منتصف مراحل تكوين البويضات (المرحلة 9)، والخلايا الحدود فصل من جيرانهم وتهاجر بين الخلايا الممرضة للوصول إلى البويضة في الخلفي من الغرفة البيض 5،7. يجب إنجاز هذه الحركةبينما تبقى الخلايا الحدود في كتلة المحيطة خليتين القطبية غير متحركة، مما يجعل هذا النوع من الهجرة الخلية الجماعية. الهجرة الناجحة من الكتلة خلية الحدود يضمن التنمية السليمة للبويب من قشرة البيضة، وهو أمر ضروري للإخصاب.
الخلايا القطبية الأمامية إرشاد مصير خلية الحدود من خلال تفعيل شلال نقل الإشارة. الخلية القطبية تفرز السيتوكينات، المفردة (UPD)، التي تربط لمستقبلات عبر الغشاء، Domeless (القبة)، وعلى خلايا بصيلات المجاورة خلال المرحلة 8 من تطوير بويضة 8،9. ربط UPD يسبب يانوس التيروزين كيناز (JAK) إلى الفوسفات ومحول الإشارات والمنشط من النسخ (STAT) 8،10،11. STAT ثم ينتقل إلى النواة لتفعيل النسخ. خلايا الحدود بطيئة (SLBO) هو عامل النسخ هذا هو الهدف النسخي المباشر للSTAT ومطلوب أيضا للهجرة الخلايا الحدود 12. إطلالة جانبية على غرف بيضة تشير روينظم قبعة النشاط STAT في التدرج عبر الظهارة الأمامية 8،11،13. خلايا بصيلات الأقرب إلى الخلايا القطبية وتحتوي على أعلى مستويات تنشيط STAT، وبالتالي فإنها تصبح خلايا الحدود وتغزو الأنسجة خط الجرثومية المجاورة.
أن نفهم كيف يتم تحديد الخلايا الحدود داخل وفصل من ظهارة، نحن بحاجة لمراقبة كيفية تنظيم الأنسجة. وإذا نظرنا إلى غرف البيض من منظور الأمامي على ذلك، فإننا نتوقع التماثل شعاعي من النشاط STAT في خلايا بصيلات المحيطة الخلايا القطبية. ومن شأن نهاية على وجهة نظر أيضا تظهر بشكل أكثر دقة الاختلافات في بروتينات الغشاء واجهات خلية خلية قبل وأثناء مفرزة من مقارنة الخلايا في طائرات التنسيق المختلفة. لأن غرف البيض هي مستطيل وتعلق على بعضها البعض من خلال خلايا ساق، يحلون على الشرائح أفقيا، مما يجعل من الصعب مراقبة العمارة الأمامية. وبالتالي، الكثير من المعلومات عن الخلايا في القطبين من الغرفة بيضة لهاتم استنتاجها من وجهات نظر الاطراف. ورغم أن بعض المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال حسابي اعادة البناء 3-D من المقاطع البصرية، تشتت الضوء، photobleaching من، وحدود الفقيرة القرار في محور Z جعل هذه المعلومات أقل تفصيلا ويمكن الاعتماد عليها في غياب تقنيات باهظة الثمن مثل فائقة قرار المجهري 14 . أنواع أخرى من التصوير القائم على القسم (على سبيل المثال، المجهر الإلكتروني أو مشراح باجتزاء) تتطلب التلاعب واسعة من الأنسجة، بما في ذلك الجفاف، مما يزيد من احتمال عن القطع الأثرية. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لصورة D. غرف البطن البيض في حين تستقيم. هذه الطريقة أثبتت بالفعل مفيدة في توضيح كيفية الحظ خلايا متحركة (انظر ممثل النتائج ومانينغ وآخرون، قيد الاستعراض)، ومن المرجح أن يكون أكثر قيمة على نطاق واسع في الدراسات لجوانب أخرى من مراحل تكوين البويضات.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا تصف طريقة لتركيب وصورة صغيرة، وتطوير غرف البيض من منظور نهاية جرا. يتم تحسين أساليب مشتركة لغرف البيض التصوير وجهات النظر الجانبية وتسمح في المقام الأول التصور الدقيق للخلايا بصيلات ميديو الاطراف عندما ملطخة الأجسام المضادة الفلورسنت. استخدام Z-مداخن أو 3-D إ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. 유전학. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. 유전학. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
