のアップライトイメージング<em>ショウジョウバエ</em>エッグチェンバース
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
キイロショウジョウバエの研究は、現象の広い範囲の遺伝的調節に大きな洞察を提供してきました。卵形成は、組織パターニング、細胞極性の変化、細胞周期の切り替え、および翻訳調節1,2,3,4を含む多くの異なる発生プロセスを調査する扱いやすい方法を提供するので、特に、卵の開発に関する広範な研究があった。卵形成時の重要な形態形成のイベントは（5で検討）ボーダー細胞と呼ばれる細胞のセットの仕様、運動性の獲得、および移行である。細胞移動するので、動物の形態形成の重要な特徴であり、このプロセスの遺伝的調節は、よく保存されているため、ハエで決定メカニズムは、他の文脈において重要である可能性が高い。従って、我々は国境細胞遊走の分子制御を研究している。私たちの研究のために、我々は、発展途上の卵の前極を観察する新しい方法を開発した、ここで、境界セルは、それらが詳細に開発かを検討するために、発生する。
卵巣内では、様々な発生段階の卵室が薄いシース（ 図1A）に収められていovariolesと呼ばれるチェーンに沿って存在する。各卵室は、1個の卵を形成するために移動します。卵形成の間に、いくつかの異なる細胞型が協調して開発しなければならない。 D.ショウジョウバエの卵室は、単層濾胞上皮6に囲まれた1卵母細胞を含む16生殖細胞から成る。特殊化した細胞の小さな数は、上皮の前部および後部の極で発生する、極性細胞と呼ばれる。 6-8ボーダー細胞は極性細胞5,7により誘導された卵室の前方上皮、に由来する。中期卵形成（ステージ9）では、ボーダー細胞は、その隣人から切り離し、卵室5,7の後部に卵母細胞に到達するために看護師セル間で移動する。この移動は、達成されなければならない境界セルは、この集団の細胞遊走の種類て、2つの非運動性極性細胞の周囲のクラスタに残っている。境界セルクラスタの移行を成功さは受精のために必要がある、卵の殻の卵門の適切な発展を保証します。
前極細胞は、シグナル伝達カスケードを活性化することにより、境界細胞の運命を指示する。ポーラー細胞は卵母細胞の発達8,9の段階8の間に包細胞を、隣接上、Domeless（DOME）、膜貫通受容体に結合するサイトカイン、不対（UPD）を、分泌する。 UPDの結合は、転写のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子（STAT）8,10,11をリン酸化するヤヌスチロシンキナーゼ（JAK）を引き起こす。 STATはその後転写を活性化するために、核に移動します。遅い境界細胞（SLBO）STATの直接的な転写ターゲットであり、また、境界細胞遊走12に必要とされる転写因子である。卵室の側面図は、Tを示している帽子STAT活性は、前方上皮8,11,13-全体の勾配で規制されている。極性細胞に最も近い包細胞は、このように、彼らは国境細胞になると、隣接する生殖系列の組織に侵入、活性化したSTATの最高レベルを持っている。
ボーダー細胞が内で指定されているかを理解し、上皮から切り離すために、我々は組織が編成されているかを観察する必要があります。我々は、前·オン視点から卵室を表示する場合は、極性細胞周囲の毛包細胞中のSTAT活動の放射状の対称性を期待する。エンド上のビューは、より正確に前と異なる焦点面で細胞を比較するより剥離時の膜タンパク質と細胞間のインタフェースの違いを示すであろう。卵室が楕円形と茎細胞によって互いに取り付けられているので、それらが困難前方アーキテクチャを観察すること、横方向にスライド上に沈降する。このように、卵室の極にある細胞に関する多くの情報があります側面図から推測されて。一部の情報は、光退色光セクション、光散乱、のアルゴリズムの3-D再構成、及びZ軸方向の分解能の悪い限界を介して取得することができるが、超解像顕微鏡14のような高価な技術が存在しない場合、この情報は、以下の詳細および信頼性を高める。セクションベースのイメージング（例えば、電子顕微鏡またはミクロトーム切片）他の種類のアーチファクトのために可能性を増加させる、脱水を含む組織の大規模な操作を必要とする。従って、我々は画像Dに新しい方法を開発キイロ卵室直立している。この方法は、すでに（ 審査中で、代表的な結果とマニングらを参照）運動性の細胞が運命づけられているかの解明に有用であることが証明され、卵形成の他の側面の研究でより広く貴重である可能性が高いしている。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、エンド·オン視点から卵室を開発し、マウントする方法を説明し、画像小。イメージング卵室のための一般的な技術は、横方向の景色のために最適化し、蛍光抗体で染色したときに主に内外方向包細胞の正確な可視化を可能にしている。複数の焦点面を見るのZ-スタックまたは3次元再構成助剤の使用が、それでも楕円形の卵室（ 図2D）の極の細胞内解像度には不十分で…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
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