Upright Imaging af<em> Drosophila</em> Egg Chambers
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
Undersøgelse af Drosophila melanogaster har tilvejebragt stor indsigt i den genetiske regulering af en lang række af fænomener. Især har der været omfattende forskning på æg udvikling, fordi oogenesen giver en medgørlig måde at undersøge mange forskellige udviklingsmæssige processer, herunder væv mønsterdannelse, cellepolaritet ændringer switching cellecyklus, og translationel regulering 1,2,3,4. En vigtig morfogent hændelse under oogenesen er specifikationen, køb af bevægelighed og migration af en række celler kaldet grænsekontrol celler (revideret i 5). Da celle migration er et centralt element i animalsk morfogenese, og fordi den genetiske regulering af denne proces er godt bevaret, mekanismer bestemt i fluer vil sandsynligvis være vigtigt i andre sammenhænge. Således undersøger vi den molekylære kontrol med grænsekontrol celle migration. For vores undersøgelser har vi udviklet en ny metode til at observere de forreste poler udvikle æg,hvor der opstår grænseoverskridende celler, til at undersøge, hvordan de udvikler sig i detaljer.
I æggestokken, findes æg kamre på forskellige udviklingsstadier langs kaldet ovarioles kæder, som er indkapslet i en tynd kappe (figur 1A). Hvert æg kammer vil gå på at danne et æg. Under oogenesen skal flere forskellige celletyper udvikle på en koordineret måde. D. melanogaster æg kammer består af 16 kim-linje-celler, herunder en oocyt, omgivet af et enkelt lag follikulær epitel 6. Et lille antal specialiserede celler, der kaldes polære celler, opstår på forreste og bageste poler epitelet. De 6-8 grænseoverskridende celler oprindelse i det forreste epitel af ægget kammeret, induceret af de polare celler 5,7. I midten af oogenesen (trin 9), grænseområderne cellerne løsnes fra deres naboer og migrere mellem sygeplejerske cellerne at nå ægget ved den bageste af ægget kammer 5,7. Denne bevægelse skal udføresmens de tilgrænsende celler forbliver i en klynge omkring to ikke-bevægelige polære celler, hvilket gør dette til en form for kollektiv celle migration. Vellykket migration af grænsen celleklynge sikrer korrekt udvikling af micropyle af æggeskallen, som er nødvendig for befrugtning.
De forreste polære celler instruere celleskæbnen grænse ved at aktivere en signaltransduktionskaskade. Polar celler secernerer et cytokin, Uparret (UPD), der binder til et transmembrant receptor, Domeless (DOME) på nærliggende follikelceller under trin 8 oocytudvikling 8,9. Bindingen af UPD forårsager Janus tyrosinkinase (JAK) at phosphorylere signaltransducer og aktivator af transkription (STAT) 8,10,11. STAT flytter derefter til kernen for at aktivere transkription. Langsomme Border Cells (SLBO) er en transskription faktor, er en direkte transkriptionel mål for STAT og er også nødvendig for grænsen cellemigration 12. Lateral udsigt over æg kamre angiver that STAT virksomhed er lovreguleret i en gradient på tværs af forreste epitel 8,11,13. Follikelceller tættest på polære celler har de højeste niveauer af aktiveret STAT, således de bliver grænserne celler og invaderer den tilstødende kim-line væv.
For at forstå, hvordan de tilgrænsende celler er beskrevet i og løsnes fra epitel, vi har brug for at observere, hvordan vævet er organiseret. Hvis vi ser æg kamre fra en anterior-on perspektiv, ville vi forvente, radial symmetri STAT aktivitet i follicle celler, der omgiver de polære celler. En ende på visning ville også mere præcist viser forskelle i membranproteiner og celle-celle-grænseflader før og under løsgørelse end sammenligne celler i forskellige fokale planer. Fordi æg kamre er aflange og knyttet til hinanden ved stilk celler, de rette på dias sideværts, hvilket gør det vanskeligt at observere den forreste arkitektur. Således mange oplysninger om cellerne ved polerne af ægget kammeret harblevet udledes laterale visninger. Selv om nogle oplysninger kan fås gennem algoritmiske 3-D rekonstruktioner af optiske sektioner, lysspredning, fotoblegning og fattigere grænser for opløsning i Z-aksen gør oplysningerne mindre detaljerede og pålidelige i mangel af dyre teknikker som super-opløsning mikroskopi 14 . Andre typer sektion baseret billeddannelse (f.eks elektronmikroskopi eller mikrotomsektionering) kræver omfattende manipulation af væv, herunder dehydrering, hvilket øger sandsynligheden for artefakter. Således har vi udviklet en ny metode til at afbilde D. melanogaster æg kamre mens oprejst. Denne metode har allerede vist sig nyttig i at belyse, hvordan motile celler skæbnebestemt (se Repræsentative resultater og Manning et al, under revision), og vil sandsynligvis være mere bredt værdifuld i studier af andre aspekter af oogenesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode til at montere og image lille, udvikler æg kamre fra en ende-on perspektiv. Fælles teknikker til billeddannelse æg kamre er optimeret til laterale synspunkter og primært tillade præcis visualisering af medio-lateral follikelceller når farvet med fluorescerende antistoffer. Brugen af Z-stakke eller 3-D rekonstruktioner hjælpemidler i visning af flere fokusplaner, men stadig er utilstrækkelig for sub-cellulær opløsning af polerne af elliptiske æg kamre (figur 2D). Men…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. 유전학. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. 유전학. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
